化工儀器網
技術文章
常見污染培養細胞的類型探究
閱讀：87 發布時間：2024-6-12 由于缺乏機體免疫系統等的保護，體外培養的細胞沒有對微生物的防御能力。在體外培養環境中，有些微生物在攝取營養物質方面有競爭優勢，并在短時間內排出大量代謝產物；有些微生物則附著在細胞表面或進入細胞內部。因此，微生物污染會對體外培養細胞的正常生存、生長及功能活動造成極大干擾，嚴重的可致細胞死亡。同時，實驗結果的準確性和可靠性也大打折扣。所以，保持細胞生存環境無微生物污染是體外實驗的前提條件。良好的無菌操作可大大降低細胞培養中的微生物污染風險。
微生物對細胞的影響因污染物和細胞種類的不同而表現各異，一般當污染物持續存在時，輕者細胞增殖生長緩慢，分裂相減少，細胞變粗糙，輪廓折光增強；重者細胞停止增殖，細胞質中出現大量堆積物，細胞變圓或從瓶壁脫落。
若發生微生物污染，一般應及時將被污染的培養物及相關試劑在滅菌后按正規程序丟棄，與被污染培養物接觸過的器材也應及時消毒滅菌，防止污染的再次發生。微生物污染的消除非常困難，且應保持隔離并嚴密監控，因此不要輕易嘗試消除污染，除非細胞至關重要且不可替代。由此可見微生物污染的預防十分重要。為此，首先介紹如何判斷常見的污染。
常見污染細胞的微生物有細菌、真菌、支原體、病毒等，不同污染物對細胞的影響有區別，真菌和細菌繁殖迅速，能在很短時間內（如48 h）壓制細胞生長或產生有毒物質，而支原體和病毒對細胞形態和機能的影響是長期的、緩慢的和潛在的。細菌、真菌的污染可通過肉眼和常規顯微鏡觀察到，支原體、病毒污染的確定則一般需借助其他檢測方法。
一、細菌污染
細菌是一類細胞細而短（細胞直徑約0.5 μm，長度約0.5 ~ 5 μm）、結構簡單、細胞壁堅韌、以二等分類方式繁殖和水生性較強的原核微生物。細菌增殖速度很快，能短時間在培養系統內產生大量細菌，從而導致培養基渾濁（有時靜置的培養基初看不渾濁，但稍加振蕩，就有很多渾濁物漂起；有時在培養基表面會出現輕微的薄膜或泡沫，或在培養物生長表面出現點狀物，移動培養器皿時則消散）并變為黃色（細菌污染后大多能改變培養基pH）。用倒置相差顯微鏡觀察，視野內可見點狀的細菌顆粒，并可能出現由細菌遷移引起的閃動，一些細菌會成團或結合培養的細胞。
在細菌污染初期，若使用了抗生素，其繁殖處于抑制狀態，細胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置相差顯微鏡也不易觀察、判斷，此時若懷疑有細菌污染，可用無抗生素的培養液常規培養觀察。若未使用抗生素，培養液改變不明顯，但又疑有污染，可取一份培養基樣本接種到營養瓊脂培養檢測。
需注意細菌污染有時可能會和培養基組分的沉淀或細胞碎片混淆，但細菌形態一致，而沉淀或碎片則形態不同，并且通常大小不一；細菌團可能與沉淀的蛋白質混淆，但細菌團內可見很多單個或成串的細菌（特別是晃動后），蛋白質沉淀則不然。
細菌數量較多時會使原先清晰的培養背景變得模糊，甚至覆蓋培養物，對培養物的生存構成直接的威脅。迅速增殖的細菌，會消耗營養液和產生毒素從而抑制細胞生長，毒性大的細菌會很快導致細胞崩解死亡。
二、支原體污染
支原體是介于細菌和病毒之間能獨立生活的最小微生物，無細胞壁，形態多變，大小介于0.2 ~ 2 μm之間，多吸附在細胞表面或散在于細胞之間。不同支原體的生物學性狀有很大差別，一般對熱敏感，對青霉素普遍有抗藥性。由于支原體無致死細胞毒性且可與細胞長期共存，故培養基一般不發生渾濁，無明顯變化，或有微細變化卻由于傳代和換液而被緩解。除了細胞培養狀況不佳，采用常規顯微鏡并不容易觀察支原體污染，其檢出需借助熒光染色、PCR、ELISA、免疫染色、放射自顯影術、微生物學分析等方法，其中采用核酸熒光染料進行DNA染色是簡單和最可信的方法之一。
當進行熒光染色時，在40×或100×物鏡下支原體可被顯示為細胞質上明確的微粒或絲狀染色，一般大小、性質一致，此時同樣被亮染的培養細胞的細胞核可作為陽性對照。確定是否存在支原體污染需盡可能多地觀察染色樣本，因為不是所有培養的細胞都會被污染。
用熒光染色法進行支原體檢測時，培養物的細胞碎片可能會造成假陽性結果，但細胞碎片不會出現清晰的點狀或絲狀支原體形態。若仍不能確認，可吸取適量待檢培養基與指示細胞（為已明確無支原體污染且是支原體的適宜宿主，同時生長良好，有足夠的細胞質以顯示粘附的支原體，如MDCK細胞）共培養，然后熒光染色來觀察指示細胞表面是否有支原體，從而避免誤判。
運用熒光染色法有時會觀察到細胞質存在均勻亮染，這可能是由RNA引起的，這類熒光會逐漸變暗，可將染色樣本干燥避光保存后在第2天觀察。如果對熒光檢測的結果存在懷疑，可重復檢測或采用其他方法再次檢測。
支原體可黏附在宿主細胞表面，從細胞膜獲取脂質和膽固醇，造成細胞膜損傷。支原體能抑制細胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細胞抗原性，導致染色體畸變，干擾病毒復制以及具有類似病毒的作用。不同細胞對支原體的感受性和反應存在差異。
急性支原體污染可能會引起培養細胞狀況的全面惡化，但很多支原體生長緩慢且不破壞宿主細胞（特別是連續培養的細胞株），它們可通過很多不同的途徑改變培養物的行為和代謝。若細胞被支原體長期污染，會出現增殖減慢、飽和密度下降等，污染嚴重的情況下細胞會從培養器皿脫落，另外懸浮培養的細胞還會出現凝集現象。
三、真菌污染
真菌是一類低等的真核生物，無法進行光合作用，以孢子進行繁殖，一般有發達的菌絲體，異養吸收型，陸生性較強。真菌種類繁多，形態各異，若發生真菌污染，大多肉眼可見白色或淺黃色小點漂浮于培養基表面，短期內培養基多不渾濁，某些真菌污染會導致培養基的pH升高；顯微鏡下觀察，可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫于細胞之間，懸浮在培養液之中，有時還會產生孢子團，酵母菌和念珠菌則表現為獨立的卵圓形顆粒，并可能出芽。真菌生長迅速，能在短時間內抑制細胞生長或產生有毒物質殺死細胞，且會在培養板孔間蔓延而很快波及鄰孔。
（細胞培養實驗常見微生物污染示例（A）培養中的神經細胞被細菌污染的早期表現，從胞質開始出現形態改變（↑所示）；（B）桿菌污染的革蘭染色診斷，▲示革蘭陽性桿菌，Δ示細胞碎片；（C）支原體污染的表現之一，細胞出現縮和碎片化的改變（↑所示，確診需要結合分子標志物檢測）；（D）霉菌污染，硫堇染色，▲示菌絲，Δ示細胞碎片。）
四、病毒污染
病毒為一種大小以納米計、不能獨立地利用外界營養物質進行自體繁殖的微生物。病毒種類復雜，相應宿主細胞有特異性，而感染了病毒的宿主細胞形態學上不一定有顯著的特異性改變，因此僅靠目測或顯微鏡觀察不能達到檢測目的。應根據不同的病毒選用不同的方法來檢測，常規有紅細胞吸附試驗、動物接種檢查、電子顯微鏡檢查、免疫學檢測和PCR等，因屬病毒學的研究范疇，普通實驗室不易推廣。病毒進入細胞后，可改變培養物的生物學性狀，影響培養細胞的生長或干擾實驗結果的客觀性。
為杜絕上述污染，可從以下幾個方面做好預防工作：
1、培養環境：
1）無菌室：保持清潔，經常擦洗，使污染物不易積聚。
2）超凈臺：①定期維護和保養，按廠家規定定期清洗和更換空氣濾器，經常保持清潔并用75%乙醇消毒；②操作前提前30 min啟動超凈臺紫外燈消毒；③存放的物品應全面消毒，并盡可能只將立即使用的物品放入；④細胞培養操作時應盡量保持層流，避免氣霧狀污染物進入培養器皿；⑤操作中濺出的液體應及時擦去，并用75%乙醇擦拭消毒；⑥實驗完畢后，移走所有物品，并用75%乙醇擦洗工作臺。
3）二氧化碳培養箱：①由于箱內潮濕，溫度適宜，有利于微生物生長，故應定期對培養箱進行清潔和消毒處理。將隔板、水盤和可拆卸部分取出，按去污劑擦洗、清水沖洗、消毒劑擦洗、紫外線照射30min的順序處理，然后放回箱內；②水盤內使用滅菌蒸餾水或添加真菌抑制劑如硫酸銅（會腐蝕不銹鋼等材質的水盤）或專用滅菌水，并注意及時更換新鮮水；③盡量減少開門次數，降低污染機會；④若取存細胞時不慎將培養液漏出，經及時用75%乙醇擦拭消毒。
2、物品的消毒滅菌：
①操作前應做好所用器皿、試劑的消毒滅菌工作；
②高壓蒸汽滅菌是常用的方法，不能采用此法滅菌的器皿、試劑，應采用其他消毒滅菌方法，如培養基等試劑可過濾除菌，蓋玻片等器械可用75%乙醇浸泡消毒后置于無菌環境中晾干；
③若物品消毒滅菌后長時間未使用，應重新處理。
3、個人衛生：
操作前洗凈雙手，操作時穿清潔的長外衣，同時佩戴無菌的手套、口罩和帽子，手套經常用75%乙醇擦拭消毒。
4、無菌操作：
防止污染的關鍵在于嚴格無菌操作。無菌意識不強、動作不準確、操作不熟練等都會造成污染。注意事項主要如下：
①細胞培養的操作一定要在超凈臺等層流裝置內進行，無菌的試劑、器械一定要在無菌區開封；
②操作時減少交談、咳嗽等防止來自唾沫和呼出氣流造成的污染；
③培養試劑不宜過早開瓶，操作時應盡可能保持瓶體傾斜，所有瓶口不能與超凈臺的風向相逆，使用后應立即封閉瓶口；
④培養的細胞處理前也不要過早暴露于空氣中；
⑤不要在打開器皿上方操作；
⑥不允許用手觸及器皿的無菌部分（如瓶口、瓶蓋內側）；
⑦吸取液體時應專管專用，及時替換；
⑧若無菌器物的頂端接觸到非無菌物品表面，應及時更換；
⑨為確保培養物的安全，應盡早凍存有價值的培養物；
⑩對新引進的細胞株、血清等生物材料應先隔離培養觀察，防止外來的污染源。
5、抗生素：
沒有哪種抗生素都能抑制所有微生物，即使聯合使用也難以根chu污染。抗生素對細胞生長有一定影響，由抑菌引起的共生現象亦可導致實驗假象；持續使用會導致慢性微生物污染（在這種情況下，微生物被抗生素抑制，但沒有被殺死，它們會在培養體系中存留，大部分時間檢測不到，但當條件改變時會再次出現），同時還會使微生物產生抗藥性的幾率大大增加，因此其使用需謹慎，不要讓培養物長期處于抗生素中。只要操作與條件合格，最好不添加。