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ELISA試驗(yàn)重點(diǎn)操作步驟闡述
閱讀：112 發(fā)布時(shí)間：2024-6-24酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一種特殊的試劑分析方法，在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)，其試劑易于保存、結(jié)果判斷較為客觀，是目前實(shí)驗(yàn)室檢測抗原抗體經(jīng)濟(jì)、普遍的試驗(yàn)診斷方法。ELISA試驗(yàn)重點(diǎn)操作步驟闡述如下：
1 、試劑的準(zhǔn)備
試劑的質(zhì)量如抗原抗體的純度及親和力、標(biāo)記物的比活性、滴度及特異性等直接影響檢測結(jié)果，為保證檢測質(zhì)量，所有試劑必需經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊批準(zhǔn)、批檢測合格，臨床評(píng)估特異性、敏感性、穩(wěn)定性較高且在有效期內(nèi)才有使用價(jià)值。不同試劑敏感性、特異性不盡相同，有報(bào)道不同酶標(biāo)板孔間 A 值差大小可達(dá) 15%，標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定性也相差較大，所以合理有效的試劑選擇尤為重要，對(duì) ELISA 試劑盒應(yīng)正確選擇，定期評(píng)價(jià)并建立科學(xué)的接收標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合常規(guī)血液篩查情況，對(duì)實(shí)際的均一性、適用性、穩(wěn)定性，選出靈敏度、特異度及精密性合適的試劑保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確。有報(bào)道不同-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶結(jié)合物溶液對(duì)檢測結(jié)果有區(qū)別，配制抗 HCV-cAg 酶結(jié)合物溶液前應(yīng)檢測小鼠-IgG 與產(chǎn)品的適配性。其次試劑盒的儲(chǔ)存方式、運(yùn)輸條件及有效期均為影響檢測結(jié)果的重要因素，試劑盒一般 2~8℃冰箱保存，注意不要緊貼冰箱儲(chǔ)存室后壁以防止試劑凍結(jié)失效，可避免使用時(shí)試劑受溫差影響導(dǎo)致酶標(biāo)板上凝集小水珠及反應(yīng)出現(xiàn)溫差而影響抗原抗體的反應(yīng)。使用前需將試劑盒放置 37℃恒溫箱溫育30min，且不同、不同批號(hào)的試劑不能混合使用。剩余試劑應(yīng)及時(shí)放入干燥劑密封保存在 2~8℃冰箱，試劑打開后一周內(nèi)有效，同時(shí)注意做好室內(nèi)質(zhì)檢，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
不同方法學(xué)的檢驗(yàn)試劑會(huì)使乙肝兩對(duì)半結(jié)果出現(xiàn)不同，如臨床操作中電化學(xué)檢測 HBsAg 呈陽性，而采用 ELISA 檢測則呈陰性，此外，使用單抗或多抗試劑對(duì)檢測結(jié)果同樣造成一定的影響。研究表明 ELISA 檢測細(xì)胞因子時(shí)需要根據(jù)檢測的細(xì)胞因子選擇不同的裂解液進(jìn)行處理，避免裂解液對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生影響導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
2、 樣本的采集、保存及預(yù)處理
標(biāo)本的運(yùn)輸及保存、檢測人員的自身素質(zhì)均可能對(duì)檢測結(jié)果造成不良影響，為避免出現(xiàn)錯(cuò)誤樣品應(yīng)準(zhǔn)確標(biāo)明編號(hào)、種類、受檢者姓名及采集時(shí)間，收集后認(rèn)真核對(duì)，拒收不符合要求的標(biāo)本及申請單，嚴(yán)格按照拒收制度處理，同時(shí)處理合格標(biāo)本，做好后續(xù)工作，避免延誤導(dǎo)致標(biāo)本出現(xiàn)溶血等其它不良情況。標(biāo)本的預(yù)處理對(duì)檢測結(jié)果有非常明顯的影響，臨床工作中有時(shí)為了快速得出檢測結(jié)果在血液開始凝固前強(qiáng)行離心分離血清，血清中殘留的纖維蛋白絲對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，標(biāo)本離心需*且必須待血液凝固后方能分離血清，也可在標(biāo)本采集時(shí)使用帶分離膠的采血管提取，使用未混入保存液的血液做檢測標(biāo)本。在此過程中保證待檢標(biāo)本新鮮、避免細(xì)菌污染，否則易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，若不能及時(shí)檢測可將分離的血清于 4℃保存，超過一周于-20℃保存，避免反復(fù)凍融，防止出現(xiàn)假陰性結(jié)果。若血清中含有類風(fēng)濕因子或免疫復(fù)合物也將造成假陽性結(jié)果。
3、加樣 ELISA 檢測
加樣時(shí)應(yīng)垂直將樣本準(zhǔn)確加入微孔底部，注意避免吸頭碰到酶標(biāo)板上的包被物，盡量慢吸快放，防止濺出或產(chǎn)生氣泡，避免液體外濺使血清殘留在反應(yīng)壁上。每次吸樣注意更換吸頭，做到一樣一吸頭，避免交叉污染，干吸頭每次加樣前在血清中抽吸三次保證吸樣準(zhǔn)確，滴加試劑時(shí)建議先將滴瓶搖勻擠去第一滴再加樣。加樣前先將微孔板平放在板架臺(tái)上，以免對(duì)洗板機(jī)的自動(dòng)操作帶來影響，為了保證加樣的準(zhǔn)確性，建議使用準(zhǔn)確性高的微量移液器且定期進(jìn)行校正。加樣品稀釋液、酶結(jié)合物應(yīng)用液、底物應(yīng)用液及終止液時(shí)可采用定量多道加液器，迅速完成加液過程，加樣后用不干膠或膠帶紙封好酶標(biāo)板防止水分蒸發(fā)或雜物進(jìn)入孔內(nèi)，注意封板膜不可二次利用，避免交叉污染，剩余的微孔板、不干膠或膠帶紙與干燥劑一同保存在備用自封塑料袋中。大批量檢測大型機(jī)構(gòu)體檢標(biāo)本時(shí)可采用直接加入適量血清的加樣模式，經(jīng)濟(jì)環(huán)保提高工作效率。
在實(shí)際操作過程中，待檢標(biāo)本和酶標(biāo)志物先后順序加入，于是在競爭法中因?yàn)閮烧叩牟煌瑫r(shí)加入而存在一個(gè)“bu公平"競爭現(xiàn)象，研究表明，競爭法 ELISA 檢測受加樣方法的影響存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將標(biāo)本和酶標(biāo)志物先在試管中等量混和均勻后再加入酶標(biāo)板小孔杯中可降低抗-HBc 檢測的假陽性率。
4、 溫育
溫育是 ELISA 至關(guān)重要的一步，不同的溫育環(huán)境對(duì)檢測結(jié)果有影響，操作中應(yīng)嚴(yán)格按照說明書控制溫育時(shí)間及溫度，并注意封閉避免邊緣效應(yīng)。為確保各板溫度都能迅速達(dá)到平衡，不可將反應(yīng)板疊加放置，設(shè)定的溫度及時(shí)間嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，一般加入待測標(biāo)本后使其與固相抗原(抗體)置于 37℃環(huán)境下溫育。因?yàn)楹芏嗪銣叵涞臉?gòu)造，溫度及檢測的溫度并非酶標(biāo)板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時(shí)建議將溫度計(jì)置于酶標(biāo)板旁，保證酶標(biāo)板旁溫度為 37℃。干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫，注意將固相板放入水中，防止受熱不均勻。
溫育時(shí)間是影響檢測結(jié)果的一大因素，實(shí)際操作過程中工作人員常常試圖縮短溫育時(shí)間提高工作效率，曹青梅等通過實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于低濃度的標(biāo)本，待測標(biāo)本與固相抗體反應(yīng)時(shí)間過短，極易引起漏檢，反應(yīng)時(shí)間最少 30min 以上。羅保紅等報(bào)道，酶標(biāo)反應(yīng)預(yù)孵時(shí)間在溫室中不超過 15min，不但能保障 ELISA 檢測抗-HIV、抗-HCV 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還能提高試劑檢測的靈敏度。其傳統(tǒng)溫育采用水溫箱易受污染，現(xiàn)多采用電熱、電子恒溫培養(yǎng)箱溫育，研究表明溫育方式對(duì) ELISA 檢測物影響。陳懷霞報(bào)道，ELISA 檢測中，溫度對(duì)抗原、抗體及酶反應(yīng)的影響很大，溫度增高，分子運(yùn)動(dòng)加速，并可能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陰性或者假陽性結(jié)果，檢測控制恒溫 37℃可保證檢測的準(zhǔn)確性。
5、 洗板
洗板目的在于將特異性結(jié)合于固相上的抗原(抗體)與溫育過程中吸附的非特異性成份分離，使免疫復(fù)合物與待測抗體(抗原)呈一定比例，洗板是否合格直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板應(yīng)嚴(yán)格按照說明控制洗板時(shí)間及洗板次數(shù)， ELISA 檢測一般用洗滌液洗板 3 次，洗滌液應(yīng)嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行稀釋，洗液應(yīng)注滿每個(gè)微孔并注意洗液不外溢，垂直甩板避免交叉污染，防止出現(xiàn)假陰性及假陽性結(jié)果。使用洗板機(jī)洗板可一定程度上避免環(huán)境污染、提高工作效率，洗滌開始時(shí)注意觀察每根吸液針是否一直插入孔底并吸干孔內(nèi)全部液體，嚴(yán)格按照要求設(shè)置一定的洗板時(shí)間及洗板次數(shù)。洗板過程中注意沖力大小，避免沖力過大導(dǎo)致酶結(jié)合物丟失，吸光度值偏低。洗液應(yīng)根據(jù)不同的酶標(biāo)板調(diào)整注水量，注意不要溢出孔外；稀釋洗液所用的蒸餾水或去離子水酸堿度適中，使配出的洗液 pH 在 7.2~7.6 范圍內(nèi)，用非金屬容器保存，保持液體新鮮無污染、沉淀。洗板結(jié)束后將板拍干，應(yīng)垂直扣在備好的干凈的吸水紙或毛巾上，且注意每次更新干凈的吸水紙或毛巾。
洗板時(shí)還應(yīng)注意以下問題：(1) 需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于 2μl；(2)及時(shí)更換破損吸液針，避免破壞底板包被；(3)針對(duì)不同酶標(biāo)板注意調(diào)整吸液頭下降高度，避免沖洗針頭卡住酶標(biāo)板；(4)注意調(diào)整洗液量，洗液量過多將溢出，過少將達(dá)不到洗滌效果；(5)關(guān)機(jī)前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道；(6) 不同種試劑盒的洗液嚴(yán)禁混合使用。臨床操作中，工作人員由于擔(dān)心洗板次數(shù)過少達(dá)不到去除非特異性物質(zhì)的理想效果而增加洗板次數(shù)，最近研究發(fā)現(xiàn)，隨著洗板次數(shù)的增加樣本檢測的 OD 值降低，造成假陰性結(jié)果及灰區(qū)標(biāo)本的漏檢。
6、 顯色及結(jié)果判斷
試劑顯色時(shí) A、B 液按順序加入且間隔不超過 10min，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。顯色劑不宜過多，注意避光反應(yīng)。顯色是最后一步溫育反應(yīng)，酶將無色底物催化反應(yīng)呈有色，反應(yīng)的溫度和時(shí)間均為影響結(jié)果的重要因素，目前市場上大多數(shù)進(jìn)口的 ELISA 檢測顯色溫度處于 18~30℃。一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，但陽性孔會(huì)隨時(shí)間的延長而顯色加強(qiáng)。研究表明，顯色溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有明顯影響，顯色溫度不同，試劑*低檢測能力差距非常大，溫度低于 21℃時(shí)試劑盒對(duì)于質(zhì)控物的檢出能力下降，溫度過低導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)速率變慢，顯色不充分，造成低值陽性結(jié)果的漏檢，所以操作中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度。顯色時(shí)間不宜過短，因?yàn)橐恍┑偷味瓤赡懿荒芗皶r(shí)出現(xiàn)反應(yīng)，造成假陰性結(jié)果。結(jié)果判斷應(yīng)按照說明書在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成，研究報(bào)道終止反應(yīng)后的時(shí)間對(duì) OD 值結(jié)果有明顯影響，10~15min陽性結(jié)果 OD 值逐漸下降，陰性結(jié)果的 OD 值有所上升，所以必須嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行，薛春楊等認(rèn)為結(jié)果判斷需在加入終止液后 10min 內(nèi)完成，避免出現(xiàn)孔內(nèi)結(jié)晶影響酶標(biāo)儀的測試，避免強(qiáng)光下進(jìn)行。
在加液和混合過程中產(chǎn)生氣泡、微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起吸光值的升高，易造成假陽性結(jié)果，若顯色但酶標(biāo)儀讀值為陰性的灰色值樣區(qū)的樣本不管其是否來源于高危人群均需復(fù)檢并參考參比試劑。
7、 其它因素
實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境亦是影響試驗(yàn)結(jié)果的一大因素，合理控制實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)、采光及防塵，實(shí)驗(yàn)室的溫度及濕度可使用空調(diào)加以控制，濕度控制在 35%~65%間，并避免噪音及電磁波干擾。
檢測結(jié)果對(duì)受檢者的家庭、生活及工作非常重要，可能帶來嚴(yán)重的精神痛苦及巨大的心理壓力，因此檢驗(yàn)工作者應(yīng)不斷提高自身素質(zhì)，加強(qiáng)使命感與責(zé)任心，盡職盡責(zé)認(rèn)真對(duì)待每一份待檢標(biāo)本，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化操作，試劑的選擇和準(zhǔn)備、樣品的采集和儲(chǔ)存、操作等方面，嚴(yán)格按照說明書要求，規(guī)范化操作，同時(shí)做好實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)，排除影響因素，嚴(yán)格控制試驗(yàn)環(huán)境，牢牢把關(guān)試劑選擇、試驗(yàn)溫度、儀器設(shè)備等每一環(huán)節(jié)，最大限度地降低檢測的系統(tǒng)誤差，加強(qiáng)自身理論知識(shí)的學(xué)習(xí)，在工作中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)、揚(yáng)長避短，減少人為因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響，提高檢測的準(zhǔn)確性，減少假陰性、假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。
ELISA 檢測廣泛應(yīng)用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋以及結(jié)核等傳染類疾病的診斷，對(duì)于含有疑似干擾物的待檢樣本做相應(yīng)分析，在保證結(jié)果可靠的前提下盡量避免二次抽血。為保證檢驗(yàn)工作者的自身安全，操作時(shí)必須帶好口罩、手套，穿好工作衣，嚴(yán)格進(jìn)行規(guī)范操作，防止交叉感染。有條件的情況下可使用酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀縮短反應(yīng)時(shí)間，提高工作效率。