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大鼠ELISA試劑盒中各溶液配方及作用
提質(zhì)粒是分子生物學(xué)中基本，easy的實(shí)驗(yàn)。*不需要借助大腦，直接照著提取試劑盒中的操作說明傻瓜操作即可（其實(shí)應(yīng)該由機(jī)器人在實(shí)驗(yàn)室中操作這些簡單卻耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)）。盡管操作簡單，提質(zhì)粒卻也是一個(gè)比較重要的步驟，提出質(zhì)粒的質(zhì)量和數(shù)量將直接決定著后續(xù)實(shí)驗(yàn)室的成敗。當(dāng)我們按照試劑盒中操作說明進(jìn)行操作時(shí)，我們會(huì)看到P1，P2，N3, PE，EB等不同的溶液（不同試劑盒可能標(biāo)識(shí)不同）。那么大家是否知道每瓶溶液中裝的什么？它們?cè)谫|(zhì)粒提取過程中的作用又是怎樣的？
質(zhì)粒提取采用的是強(qiáng)堿裂解法（alkaline lysis），那么我們現(xiàn)在來看一下溶液 P1 ， P2， N3, PE, EB都是什么。
溶液1（P1）
組分濃度 25 mM Tris-HCl（pH8.0），10 mM EDTA，50 mM 葡糖糖（Glucose）
溶液1的主要作用是將菌體沉淀懸浮起來。25mM Tris-HCl是緩沖溶液，保證反應(yīng)體系的pH恒定。EDTA是金屬離子螯合劑，10 mM EDTA的作用是與微生物體內(nèi)的金屬離子相互結(jié)合，抑制DNase的活性。50 mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，保證菌體懸浮，延緩菌體沉降的時(shí)間。溶液1在使用前通常要加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。由于RNA酶屬于蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性很差，所以加了RNase A的溶液1需要低溫4oC保存。
溶液2（P2）
組份濃度 250 mM NaOH，1％（W/V）SDS（十二烷基硫酸鈉）
溶液2的主要作用是細(xì)胞裂解。溶液1將細(xì)胞懸浮后，就需要添加溶液2了，溶液2的作用就是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。溶液2只包括兩種成分：氫氧化鈉和SDS。真正起到到細(xì)胞裂解作用的是氫氧化鈉，這也是為什么這個(gè)方法會(huì)被叫做堿裂解法。氫氧化鈉會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使之發(fā)生bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞的裂解。SDS的作用將在下一步提到。添加溶液2后需要注意的一個(gè)是時(shí)間一定不能過長，另一個(gè)是不可以劇烈震動(dòng)離心管。時(shí)間過長以及劇烈震動(dòng)都將導(dǎo)致氫氧化鈉破壞基因組DNA，斷裂的基因組DNA碎片將會(huì)與相似大小質(zhì)粒一同被抽提，污染樣品。
溶液3（N3）
組份濃度 3M 醋酸鉀（potassium acetate），5M 醋酸
溶液3的主要作用是中和第二步加入的強(qiáng)堿以及清除掉蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)。N是neutralized的縮寫。強(qiáng)堿溶液氫氧化鈉長時(shí)間與DNA基礎(chǔ)會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)，因此需要進(jìn)行中和。中和氫氧化鈉，5 M醋酸就足夠了，為何又要加入醋酸鉀呢？做過質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)的同學(xué)應(yīng)該記得，在加入溶液N3后，會(huì)有大量沉淀出現(xiàn)。這些沉淀其實(shí)醋酸鉀與溶液2中的SDS相互作用，反應(yīng)生成的十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS）。加入溶液N3后，SDS遇到鉀離子，生成PDS不溶于水，會(huì)迅速發(fā)生沉淀。
那么溶液3的加入是如何清除掉蛋白質(zhì)，基因組DNA等雜質(zhì)的呢？道理是，溶液2中加入的十二烷基硫酸鈉(SDS)很容易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸就會(huì)結(jié)合一個(gè)SDS分子，二者結(jié)合會(huì)形成SDS2多肽復(fù)合體，這樣變性蛋白質(zhì)將溶解在溶液中，從而使得多肽鏈更好地與基因組DNA纏繞。加入溶液3后，由于十二烷基硫酸鹽與變性蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合體，十二烷基硫酸鉀的沉淀就將變性的蛋白質(zhì)一起沉淀，同時(shí)變性的蛋白質(zhì)與基因組DNA纏繞，結(jié)果也大部分被共沉淀了。而高離子濃度的溶液又加速了這一沉淀過程。此外，溶液被中和后變性蛋白質(zhì)表面電荷減少,也可以促進(jìn)變性蛋白質(zhì)沉淀。
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