人NK細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品：小鼠膽管成纖維細(xì)胞裂褶菌Schizophyllum commune Fr.小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞醋酸菌Acetobacter sp.小鼠胎鼠真皮成纖維細(xì)胞蘇云金芽孢桿菌BacillusthuringiensisBerliner兔頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)根土壤桿菌（發(fā)根植物單胞菌）Agrobacteriumrhizogenes(Rikeretal.)Conn

一、細(xì)胞基本屬性：

 

包被條件： 

培養(yǎng)基：原代NK細(xì)胞培養(yǎng)體系

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣 ，95%；  CO2 ，  5%

原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺(tái)中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開(kāi)顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

原代細(xì)胞使用方法：

是一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈，在技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下，細(xì)胞可傳2-3代；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

客戶收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基。

3. 細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液，1000rpm，離心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm，離心5min，丟棄上清，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

5)原瓶?jī)?nèi)貼壁細(xì)胞按正常消化處理。

4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

因原代細(xì)胞貼壁特殊性，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時(shí)，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被，以增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性，避免細(xì)胞因沒(méi)貼好影響實(shí)驗(yàn)；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%），依據(jù)細(xì)胞種類而定。懸浮/半懸浮細(xì)胞無(wú)需包被。
公司正在出售的產(chǎn)品：
小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞266-6

人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U-118 MG(STR鑒定正確)
鯉魚上皮細(xì)胞EPC
大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞INS-1（種屬鑒定）
永生化人肥大細(xì)胞系 LUVA
大鼠 Wistar 肉瘤細(xì)胞，XC（種屬鑒定）
小鼠乳腺癌細(xì)胞帶綠色熒光4T1+GFP （種屬鑒定）
人腦瘤細(xì)胞SF126(STR鑒定正確)
人喉癌細(xì)胞 TU686(STR鑒定正確)
小鼠神經(jīng)干細(xì)胞C17.2 （種屬鑒定）
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞COLO 201(STR鑒定正確)
人胰腺癌細(xì)胞Patu8988T(STR鑒定正確)
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞帶熒光素酶NCI-H1299+LUC(STR鑒定正確)
MC3T3-E1Subclone 14 小鼠顱頂前骨亞克隆14（種屬鑒定）
人胃癌細(xì)胞MGC-803 (STR鑒定正確)
Lactobacillus panis面包乳桿菌
Aquaspirillum sp.水螺菌
Acinetobacter junii瓊氏不動(dòng)桿菌
Xanthomonas campestris pv. malvacearum野油菜黃單胞菌錦葵致病變種
Halococcus qingdaonensis青島鹽古球菌
Halovivax asiaticus亞洲長(zhǎng)生嗜鹽古菌
Natronorubrum aibiense艾比嗜鹽堿紅菌
Providencia stuartii斯氏普羅威登斯菌
Staphylococcus xylosus木葡萄球菌
Rhodococcus equi馬紅球菌
人NK細(xì)胞Halomonas sp.鹽單胞菌
Corynebacterium minutissimum極小棒桿菌
Cryobacterium psychrophilum喜冷冷桿菌
Haloarcula argentinensis阿根廷鹽盒菌
Haloarcula quadrata方形鹽盒菌