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液相色譜分析條件的選擇
閱讀：1343 發(fā)布時(shí)間：2010-9-19
在液相色譜分析過程中，我們經(jīng)常遇到的問題主要有二種，一種與液相色譜儀器本身因素有關(guān)，如液相色譜的閥門、混合器、檢測器的光源以及其它的一些硬件設(shè)備。出現(xiàn)這類問題后，如果能找出問題根源，解決起來一般很簡單，而且這類問題可以通過對儀器的精心維護(hù)來避免;而另一類問題則是分析方法本身造成的問題，如出現(xiàn)色譜峰形狀不好、峰與峰之間不能分開、基線飄移等等。不幸的是，如果出現(xiàn)這類問題，看起來似乎很明顯，但是要找出原因并解決這類問題卻非常困難。為了減少出現(xiàn)這一類型的問題，就必須在分析之前，仔細(xì)研究并選擇一個(gè)好的分析方法，有了一個(gè)好的分析方法，就很容易獲得理想的分離效果，而且在出現(xiàn)問題是也很便于找出原因。要選擇一個(gè)好的分析方法，就必須對液相色譜分析的一些基本原則要有一個(gè)很深的了解。下面是我們實(shí)驗(yàn)室對色譜分析人員進(jìn)行技能培訓(xùn)的一些基本知識。
一：分析方法選擇的基本原則
假如你想做一頓豐盛的晚餐，首先必須看一下食譜，然后檢查一下你所需的東西是否齊全，如果少了配料還必須去商店購買，這樣你才可能做出一頓可口的晚餐。同樣進(jìn)行液相色譜分析時(shí)，也必須按照一定的程序進(jìn)行，首先你必須要有專門的儀器和試劑，然后有目的地選擇分析方法，這樣你才可能得到好的分析結(jié)果，避免走一些彎路。
假如你想做一頓豐盛的晚餐，首先必須看一下食譜，然后檢查一下你所需的東西是否齊全，如果少了配料還必須去商店購買，這樣你才可能做出一頓可口的晚餐。同樣進(jìn)行液相色譜分析時(shí)，也必須按照一定的程序進(jìn)行，首先你必須要有專門的儀器和試劑，然后有目的地選擇分析方法，這樣你才可能得到好的分析結(jié)果，避免走一些彎路。
二：柱子的選擇
在液相色譜分析方法中zui重要的就是色譜柱的選擇，色譜分析人員面對幾百種色譜柱，你從何入手呢?我采取的方法就是訂閱 LCGC亞太版中Ron Majors 的“色譜柱觀察”這一專欄，自1984（1）年以來，Ron Majors在這一專欄中介紹許多新柱子、色譜柱新技術(shù)、色譜柱使用方法等方面的信息。
現(xiàn)在大部分液相色譜分析都是使用反相色譜柱，其中以C18 和C8柱zui為流行。然而色譜分析并不是流行歌曲，這兩種色譜柱之所以運(yùn)用廣泛是因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，使用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子（如表一所示），但 C18和C8經(jīng)常是的固定相，C18和C8柱兩者之間并無明顯的差別，但在我們實(shí)驗(yàn)室中以常使用的是C8柱。
色譜分析人員遇到的多數(shù)樣品需要利用反相色譜柱進(jìn)行分析，但一些樣品可能需要其它的分析技術(shù)才能成功地分離，這些樣品及分離方法在表一中作了簡要的敘述，在以后的章節(jié)中將進(jìn)一步闡述。
在液相色譜分析方法中zui重要的就是色譜柱的選擇，色譜分析人員面對幾百種色譜柱，你從何入手呢?我采取的方法就是訂閱 LCGC亞太版中Ron Majors 的“色譜柱觀察”這一專欄，自1984（1）年以來，Ron Majors在這一專欄中介紹許多新柱子、色譜柱新技術(shù)、色譜柱使用方法等方面的信息。
現(xiàn)在大部分液相色譜分析都是使用反相色譜柱，其中以C18 和C8柱zui為流行。然而色譜分析并不是流行歌曲，這兩種色譜柱之所以運(yùn)用廣泛是因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，使用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子（如表一所示），但 C18和C8經(jīng)常是的固定相，C18和C8柱兩者之間并無明顯的差別，但在我們實(shí)驗(yàn)室中以常使用的是C8柱。
色譜分析人員遇到的多數(shù)樣品需要利用反相色譜柱進(jìn)行分析，但一些樣品可能需要其它的分析技術(shù)才能成功地分離，這些樣品及分離方法在表一中作了簡要的敘述，在以后的章節(jié)中將進(jìn)一步闡述。
表一：樣品及分析方法
樣品的特性分析方法及色譜柱
大分子量色譜柱、離子交換柱、 size-excusion色譜柱
手性異構(gòu)體手性色譜柱
其它異構(gòu)體（位置、立方體） 正相色譜柱、沒有改性的二氧化硅柱
無機(jī)鹽混合物離子色譜分析
碳水化合物（糖類） 反相氨基柱、離子交換法
在過去的15年中，高純度、低金屬雜質(zhì)含量的硅膠基質(zhì)色譜柱是zui為實(shí)用的色譜柱之一。但傳統(tǒng)色譜分析用的硅膠顆粒具有差異性及酸性表面，固定在柱子表面后，導(dǎo)致出現(xiàn)拖尾峰，而且柱與柱之間的重現(xiàn)性較差（2.3）。zui近硅膠基質(zhì)中出現(xiàn)一種新的產(chǎn)品，這種硅膠具有Metal-free 特性，因此柱子性能更穩(wěn)定，重現(xiàn)性也更好，分離后峰的形狀也很不錯(cuò)。這種改性后的硅膠稱為B型硅膠。由于具有上述優(yōu)點(diǎn)，大多數(shù)色譜制造商都用不同的名稱來表明它們與傳統(tǒng)的產(chǎn)品之間的不同，如Intertsil （日本）、 BDS（USA）、YMC--Base（USA）等等。大多數(shù)色譜柱制造商都生產(chǎn)以B型硅膠為基質(zhì)的色譜柱，因此你可以選擇你所喜歡的供應(yīng)商提供的產(chǎn)品。由于這種產(chǎn)品具有上述特性，建議使用A型硅膠柱的改為使用B硅膠柱。
樣品的特性分析方法及色譜柱
大分子量色譜柱、離子交換柱、 size-excusion色譜柱
手性異構(gòu)體手性色譜柱
其它異構(gòu)體（位置、立方體） 正相色譜柱、沒有改性的二氧化硅柱
無機(jī)鹽混合物離子色譜分析
碳水化合物（糖類） 反相氨基柱、離子交換法
在過去的15年中，高純度、低金屬雜質(zhì)含量的硅膠基質(zhì)色譜柱是zui為實(shí)用的色譜柱之一。但傳統(tǒng)色譜分析用的硅膠顆粒具有差異性及酸性表面，固定在柱子表面后，導(dǎo)致出現(xiàn)拖尾峰，而且柱與柱之間的重現(xiàn)性較差（2.3）。zui近硅膠基質(zhì)中出現(xiàn)一種新的產(chǎn)品，這種硅膠具有Metal-free 特性，因此柱子性能更穩(wěn)定，重現(xiàn)性也更好，分離后峰的形狀也很不錯(cuò)。這種改性后的硅膠稱為B型硅膠。由于具有上述優(yōu)點(diǎn)，大多數(shù)色譜制造商都用不同的名稱來表明它們與傳統(tǒng)的產(chǎn)品之間的不同，如Intertsil （日本）、 BDS（USA）、YMC--Base（USA）等等。大多數(shù)色譜柱制造商都生產(chǎn)以B型硅膠為基質(zhì)的色譜柱，因此你可以選擇你所喜歡的供應(yīng)商提供的產(chǎn)品。由于這種產(chǎn)品具有上述特性，建議使用A型硅膠柱的改為使用B硅膠柱。
三：柱子尺寸規(guī)格的選擇
液相色譜分析時(shí)柱子選擇的另一個(gè)因素就是柱子大小、及填充顆粒的直徑（dp）的選擇。zui常用顆粒直徑為5μm，但顆粒的直徑（dp）為3.0及3.5μm的也適合分析使用，但大多數(shù)色譜工作者都喜歡使用顆粒直徑為5μm的色譜柱，因?yàn)檫@種色譜柱具有很長的使用歷吏。顆粒的dp小意味著可以獲得較高的理論塔板數(shù)，但所需的柱壓增大，而且dp 為3.0μm的色譜柱易堵塞，所以一些色譜制造商又生產(chǎn)出dp 為3.5μm的色譜柱。
在我們實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用的是150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱。另一種可以選擇的色譜柱為75mm×4.6mm，dp為3.5μm的柱子，這種柱子的分離效果與前一種色譜柱分離效果相似，但使用時(shí)間減小一半。這兩種柱子還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是在合理的壓力下（<2000psi ），流速可以設(shè)定在1.5--2.0ml/min之間，而流速高意味著可以縮短分析時(shí)間。
有些分析者建議使用30 or50mm長的柱子作為前處理柱，但這種柱子不能提供足夠的塔板數(shù)。另一種意見是使用窄孔柱（2mmid）或微孔柱（≤1mmid），這兩種柱子所需的溶劑少，但是這兩種柱子所需的某些儀器與正常使用的色譜儀有些不同，而且正處在一個(gè)研究階段，建議等這兩種色譜柱研究成熟之后再使用。
150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱zui為常用，75mm×4.6mm，dp為3.5μm的色譜柱也中較常見，在一般情況下流速可設(shè)定為1.5ml/min。
液相色譜分析時(shí)柱子選擇的另一個(gè)因素就是柱子大小、及填充顆粒的直徑（dp）的選擇。zui常用顆粒直徑為5μm，但顆粒的直徑（dp）為3.0及3.5μm的也適合分析使用，但大多數(shù)色譜工作者都喜歡使用顆粒直徑為5μm的色譜柱，因?yàn)檫@種色譜柱具有很長的使用歷吏。顆粒的dp小意味著可以獲得較高的理論塔板數(shù)，但所需的柱壓增大，而且dp 為3.0μm的色譜柱易堵塞，所以一些色譜制造商又生產(chǎn)出dp 為3.5μm的色譜柱。
在我們實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用的是150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱。另一種可以選擇的色譜柱為75mm×4.6mm，dp為3.5μm的柱子，這種柱子的分離效果與前一種色譜柱分離效果相似，但使用時(shí)間減小一半。這兩種柱子還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是在合理的壓力下（<2000psi ），流速可以設(shè)定在1.5--2.0ml/min之間，而流速高意味著可以縮短分析時(shí)間。
有些分析者建議使用30 or50mm長的柱子作為前處理柱，但這種柱子不能提供足夠的塔板數(shù)。另一種意見是使用窄孔柱（2mmid）或微孔柱（≤1mmid），這兩種柱子所需的溶劑少，但是這兩種柱子所需的某些儀器與正常使用的色譜儀有些不同，而且正處在一個(gè)研究階段，建議等這兩種色譜柱研究成熟之后再使用。
150mm×4.6mm，dp為5μm的色譜柱zui為常用，75mm×4.6mm，dp為3.5μm的色譜柱也中較常見，在一般情況下流速可設(shè)定為1.5ml/min。
四：有機(jī)相的選擇
獲得成功分離的另一個(gè)重要因素就是流動(dòng)相有機(jī)溶劑的選擇，如果使用反相色譜柱可以有三種有機(jī)溶劑可以選擇，甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其*的優(yōu)點(diǎn)，但色譜分析人員很少能預(yù)見哪一種溶劑更合適，所以具體選擇哪一種溶劑你必須充分考慮同行的意見。
在我的實(shí)驗(yàn)室中多數(shù)工作分析藥物中的成份，其中有些樣品的紫外吸收很弱，所以分析時(shí)紫外檢測器的波長為220nm甚至更低，但是四氫呋喃的紫外吸收比較強(qiáng)，所以在波長低于240nm時(shí)，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長下也可使用，但是在低于220nm時(shí)，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及空氣之間不發(fā)生作用，而四氫呋喃易分解，形成過氧化物，所以使用這種溶劑時(shí)須格外小心。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，在四氫呋喃中加入水可以解決這個(gè)問題（4），但它與色譜柱平衡所需的時(shí)間比甲醇、乙腈長，而且其不愉快的氣味也是一個(gè)不利因素。與四氫呋喃相比，甲醇和乙腈的zui大優(yōu)點(diǎn)是在柱壓較低的條件下，流速可控制在1-2ml/min之間。
考慮到理想溶劑的特點(diǎn)，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方便，所以的有機(jī)溶劑應(yīng)是乙腈，當(dāng)然利用甲醇作為有機(jī)溶劑的也較為常見。
獲得成功分離的另一個(gè)重要因素就是流動(dòng)相有機(jī)溶劑的選擇，如果使用反相色譜柱可以有三種有機(jī)溶劑可以選擇，甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其*的優(yōu)點(diǎn)，但色譜分析人員很少能預(yù)見哪一種溶劑更合適，所以具體選擇哪一種溶劑你必須充分考慮同行的意見。
在我的實(shí)驗(yàn)室中多數(shù)工作分析藥物中的成份，其中有些樣品的紫外吸收很弱，所以分析時(shí)紫外檢測器的波長為220nm甚至更低，但是四氫呋喃的紫外吸收比較強(qiáng)，所以在波長低于240nm時(shí)，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長下也可使用，但是在低于220nm時(shí)，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及空氣之間不發(fā)生作用，而四氫呋喃易分解，形成過氧化物，所以使用這種溶劑時(shí)須格外小心。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，在四氫呋喃中加入水可以解決這個(gè)問題（4），但它與色譜柱平衡所需的時(shí)間比甲醇、乙腈長，而且其不愉快的氣味也是一個(gè)不利因素。與四氫呋喃相比，甲醇和乙腈的zui大優(yōu)點(diǎn)是在柱壓較低的條件下，流速可控制在1-2ml/min之間。
考慮到理想溶劑的特點(diǎn)，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方便，所以的有機(jī)溶劑應(yīng)是乙腈，當(dāng)然利用甲醇作為有機(jī)溶劑的也較為常見。
五：水相的選擇
假如樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時(shí)普遍存在，而這類化合物需要控制PH值才能得到很好的分離。如流動(dòng)相的PH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個(gè)單位。在分析有機(jī)酸時(shí)，當(dāng)PH值低于3時(shí)，色譜柱一般還比較穩(wěn)定，然而當(dāng)PH值高于8時(shí)，就需要緩沖液，因?yàn)榇?/span>PH值已經(jīng)超出了二氧化硅的有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見，但是對高PH值物質(zhì)的分離，很少有這方面的報(bào)道。所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失。
考慮到樣品的特性及柱子的穩(wěn)定，建議在分析PH值較高的物質(zhì)時(shí)應(yīng)使用緩沖液，2.5mM的磷酸鹽緩沖液 （PH=2.5）是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必須選擇易揮發(fā)的緩沖液，盡管不如真正的緩沖液有用，但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿足PH值的控制要求。
假如樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時(shí)普遍存在，而這類化合物需要控制PH值才能得到很好的分離。如流動(dòng)相的PH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個(gè)單位。在分析有機(jī)酸時(shí)，當(dāng)PH值低于3時(shí)，色譜柱一般還比較穩(wěn)定，然而當(dāng)PH值高于8時(shí)，就需要緩沖液，因?yàn)榇?/span>PH值已經(jīng)超出了二氧化硅的有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見，但是對高PH值物質(zhì)的分離，很少有這方面的報(bào)道。所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失。
考慮到樣品的特性及柱子的穩(wěn)定，建議在分析PH值較高的物質(zhì)時(shí)應(yīng)使用緩沖液，2.5mM的磷酸鹽緩沖液 （PH=2.5）是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必須選擇易揮發(fā)的緩沖液，盡管不如真正的緩沖液有用，但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿足PH值的控制要求。
六：其它的因素
在你選擇液相色譜的分析方法時(shí)，必須考慮到其它的一些因素，比如溫度。因?yàn)闇囟茸兓?/span>1度，保留時(shí)間將變化1-3%，所以溫度控制十分重要，溫度的變化還影響色譜柱的選擇性，這會使你更積極地投入到溫度選擇中去。在分析時(shí)柱溫一般比室溫高一點(diǎn)（如35℃），因?yàn)榇藴匾卓刂疲以诘蛪合掠欣诮档腿軇┑恼扯龋瑥亩档椭鶋骸Ｓ袝r(shí)你需要利用其它的一些方法，如在流動(dòng)相中加入部分特殊的物質(zhì)，不過我建議在你實(shí)在必須時(shí)才用這種方法，記住KISS原則（Keep it simple ，stupid），不要使你的流動(dòng)相過分復(fù)雜!
在你選擇液相色譜的分析方法時(shí)，必須考慮到其它的一些因素，比如溫度。因?yàn)闇囟茸兓?/span>1度，保留時(shí)間將變化1-3%，所以溫度控制十分重要，溫度的變化還影響色譜柱的選擇性，這會使你更積極地投入到溫度選擇中去。在分析時(shí)柱溫一般比室溫高一點(diǎn)（如35℃），因?yàn)榇藴匾卓刂疲以诘蛪合掠欣诮档腿軇┑恼扯龋瑥亩档椭鶋骸Ｓ袝r(shí)你需要利用其它的一些方法，如在流動(dòng)相中加入部分特殊的物質(zhì)，不過我建議在你實(shí)在必須時(shí)才用這種方法，記住KISS原則（Keep it simple ，stupid），不要使你的流動(dòng)相過分復(fù)雜!
七：總結(jié)
在液相色譜分析時(shí)條件的選擇非常重要，而且流動(dòng)相是你常年與之打交道的，所以你必須慎重選擇。一些較為常見的分析條件見如表二所示。
表二
分析條件內(nèi)容
色譜柱大小 150mm×4.6mm，
顆粒 dp為5μm
固定相 C18或C8
流動(dòng)相溶劑A、B 水、乙腈B% 可變
緩沖液 2.5mM的磷酸鹽緩沖液
流速 1--2ml/min
溫度 35℃
在液相色譜分析時(shí)條件的選擇非常重要，而且流動(dòng)相是你常年與之打交道的，所以你必須慎重選擇。一些較為常見的分析條件見如表二所示。
表二
分析條件內(nèi)容
色譜柱大小 150mm×4.6mm，
顆粒 dp為5μm
固定相 C18或C8
流動(dòng)相溶劑A、B 水、乙腈B% 可變
緩沖液 2.5mM的磷酸鹽緩沖液
流速 1--2ml/min
溫度 35℃