細胞治療為疾病治愈提供了新的方法，給患者帶來新的希望。然而，由于缺乏高度癌癥特異性的表面標記物，細胞治療在免疫治療靶點的選擇上面臨挑戰，并且在應用上有一定的局限性。首先，由于正常細胞也表達靶點，使得治療中表現出顯著毒性。其次，大多數與實體腫瘤相關的抗原屬于胞內蛋白，很難被識別，所以對于大多數實體瘤，細胞治療仍顯得力不從心。
今天，陳老濕為大家推薦幾篇近期發表的細胞治療相關文章，這些研究在一定程度上提出了解決上述問題的方法。當然，這些文章均在研究過程中使用了賽多利斯的Octet® 非標記分子互作系統和Incucyte® 實時活細胞分析系統，讓我們一起來看看吧。
Octet®
Incucyte®
Nature Cancer
嶄新的方法發現更特異的腫瘤標志物！[1]
研究人員在美國加州大學舊金山分校開發了一種新方法，他們首先使用化學交聯劑將細胞表面的蛋白連接在一起，這一步驟可以在原位“凍結”蛋白質的自然構象，并保留其相關的結構信息。然后，他們對這些蛋白進行糖蛋白氧化和生物素化處理，由于生物素與鏈霉親和素有很強的結合能力，利用這種蛋白富集方法，研究人員成功地增加了對腫瘤相關肽的質譜覆蓋。這項研究發現，整合素β2的活化構象是急性白血病的一個標志物（圖1）。
圖1. 活性腫瘤表面抗原構象篩選策略
研究人員利用基于完全人類框架序列的抗原結合片段（Fab）噬菌體展示平臺，對重組整合素β2抗體進行篩選（圖2）。他們從約1010個候選結合物庫中，確定了10個與整合素β2有結合作用的候選物（Hit），其中5個通過基于生物層干涉技術（BLI）的Octet® 進行驗證，確定能與活性整合素β2結合，其中編號7065#Hit最強。
圖2.展示篩選與活性整合素β結合的Fab片段：左圖為嵌合抗原受體（CAR）篩選過程；右圖為Octet® 檢測的親和力結果
基于7065#抗體，研究人員篩選設計CAR-T細胞，并使用Incucyte® 評估了對腫瘤細胞的殺傷活性和T細胞增殖活性。結果顯示，針對活性整合素β2（aITGB2）的CAR-T細胞在殺傷活性上優于傳統的針對CD33的CAR-T細胞，同時也保持了T細胞的增殖活性。
圖3. Nomo1細胞被標記mCherry，而CAR-T細胞則被標記GFP，y軸代表通過熒光強度檢測細胞增殖的情況（mCherry上圖，GFP下圖）；在1:1的效應-腫瘤（E:T）比例下，aITGB2 CAR-T細胞毒性水平與cd33 CAR-T細胞相似（左上）；在1:10的E:T比例下，aITGB2 CAR-T細胞表現優于抗cd33（右上）；兩種CAR-T細胞在共培養實驗中表現出相似的增殖（下面兩幅圖）；使用Incucyte® 實時活細胞分析系統，每4個小時自動拍攝一次，并計算mCherry和GFP熒光
本文驗證了一種潛在的系統性方法來識別和靶向癌癥中的構象特異性抗原，基于活化整合素的CarT療法，值得在AML中進行進一步的臨床前評估，并為結構導向免疫治療靶點的其他應用提供了途徑。
Nature
新型針對實體瘤的細胞治療法[2]
實體腫瘤靶點蛋白的降解片段，可以通過主要組織相容性復合體（MHC） 呈遞到腫瘤細胞表面，并被免疫系統識別，從而殺傷腫瘤細胞。美國費城兒童醫院的研究人員非常巧妙地選擇了很難通過蛋白突變找到治療靶點的神經母細胞瘤作為研究對象，篩選出了特異存在于腫瘤細胞表面的多肽。以這些多肽為靶點，他們開發了一種新型的嵌合抗原受體CAR-T治療，并命名：PC-CAR（“Peptide-centric” Chimeric Antigen Receptors，多肽中心嵌合抗原受體）。將MHC分子結合的多肽通過類似Pull-down的方法富集，然后用質譜的方法進行鑒定，然后通過大型基因組數據進行分析對比和親和力預測，研究人員確定了一種未突變的神經母細胞瘤肽，它源自PHOX2B（一種神經母細胞瘤依賴性基因和轉錄調節因子）。以這個多肽為靶點，使用噬菌體展示的方法篩選出了特異性的ScFv作為CAR，名字為10LH，使用Octet®測得其與PHOX2B親和力為13nM。
圖4. 左圖為PC-CAR示意圖，當中紅色為呈遞的抗原；
右圖使用Octet® 固化10LH，與多肽進行結合解離；kd=76×10−4/s，KD=13 nM，而另外一種ScFv 302LH的解離速率較快，親和力較低
接下來就是以免疫細胞殺傷為主的功能實驗，而在這篇文章中這個實驗的主力就是Incucyte® 實時活細胞分析系統。在殺傷實驗中，加入Caspase 3/7 紅色熒光染料，靶點細胞（腫瘤細胞）帶GFP綠色熒光，使用Incucyte® 實時計算紅色熒光面積和綠色熒光面積。紅色熒光面積升高快，綠色熒光下降快，則代表殺傷效果越大。
圖5. Incucyte® 實時活細胞成像：a左圖為PC-CAR對SKNAS膠質瘤細胞（呈遞PHOX2B）的殺傷作用明顯，a右圖為PC-CAR對其他腫瘤細胞（不呈遞PHOX2B）的殺傷則不明顯；b圖從靶細胞動態增殖水平來觀察，發現PC-CAR對SKNAS等膠質瘤細胞的殺傷作用明顯
J Immunother Cancer
CAR親和力并不是越高越好！[3]
大約50%接受抗CD19 CAR-T細胞治療的患者會出現復發，因此，迫切需要開發新的免疫治療靶點。最近有研究發現，CD72是B細胞惡性腫瘤中一個很有潛力的新靶點。之前發現的針對CD72的羊駝來源的納米抗體（NbD4）雖然有效，但是效果不及傳統的針對CD19的CarT。因此，以NbD4為母本進行人源化，產生一系列新的CD72納米抗體。將這些納米抗體插入第二代 CD72 CAR-T 細胞中，并在體外和體內針對 B 細胞急性淋巴細胞白血病和 B 細胞非霍奇金淋巴瘤的臨床前模型進行評估。其中一種抗體克隆（H24）顯示出對B細胞腫瘤有著增強的殺傷效力，這也包括CD19 CAR-T復發后的患者來源樣本。H24 對 CD72 的結合親和力適中，而進一步的提高親和力（KD<1nM）卻不會導致細胞毒性的增強。
圖6. Octet® 結果顯示：H24親和力高于母本NbD4，主要是解離速率常數Koff變小
圖7. Incucyte® 結果顯示，H24在增加腫瘤細胞殺傷的同時（左圖），保持了T細胞的增殖活性（右圖）
圖8. 對H24進行親和力成熟并提高親和力的抗體NbD4.7,NbD4.13（左圖），并沒有增加對腫瘤細胞的殺傷活性
為什么細胞治療研究要用
Incucyte® 實時活細胞分析系統呢？
培養箱內可長達數周的連續觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細胞的傷害；只要放好您的細胞，其他交給Incucyte® 吧
6個板位，分別獨立設置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養皿，通量高
高效簡便的模塊化軟件設置和數據分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標多參數；本文提到了使用Incucyte® 多個參數的監控，使得結果更加準確
大于100種優化過的活細胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol，文章數大于12,000篇
為什么要用Octet® 呢？
非標記Direct Binding是趨勢，不需要標記和信號放大，可以更好的保持反應物的活性
快速測定親和力，提供結合速率常數和解離速率常數更加定量化地表征分子互作
無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）
寫入了美國藥典，文章>12000篇，認可度廣
萬金油技術，可以用于檢測DNA，小分子，蛋白質等各種生物分子
操作簡便，耗材及維護成本低
在賽多利斯的Octet® 分子互作分析系統和Incucyte® 實時活細胞成像這對CP的助力下，相信有更多的新型細胞治療法產生！
實時活細胞分析開啟免疫細胞殺傷實驗新格局
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-參考文獻-
[1] Mandal, K., Wicaksono, G., Yu, C. et al. Structural surfaceomics reveals an AML-specific conformation of integrin β2 as a CAR T cellular therapy target. Nat Cancer 4, 1592–1609 (2023).
[2] Yarmarkovich, M., Marshall, Q.F., Warrington, J.M. et al. Targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs. Nature 623, 820–827 (2023).
[3] Temple WC, Nix MA, Naik A, et al. Framework humanization optimizes potency of anti-CD72 nanobody CAR-T cells for B-cell malignancies. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2023;11:e006985. doi:10.1136/jitc-2023-006985
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