在科學(xué)研究的前沿，賽多利斯的Incucyte®實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)已成為眾多CNS論文的常客（相關(guān)閱讀：一天三篇CNS，Incucyte開啟細(xì)胞研究新速度）。而在今年的9月13日，又有兩篇CELL論文借助Incucyte®展示了更為豐富的數(shù)據(jù)。陳老師對(duì)此進(jìn)行了深入分析，揭示了活細(xì)胞成像在這些研究中的關(guān)鍵作用，帶來(lái)更加“可視化” 的科學(xué)視角。
01
植入“木馬”分子治療神經(jīng)退行性疾病[1]
蛋白質(zhì)聚集會(huì)導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)退行性疾病。例如，在阿爾茨海默病患者的大腦中，tau蛋白和淀粉樣蛋白錯(cuò)誤折疊并積聚成細(xì)絲狀聚集物。靶向和去除聚集體，而不是功能性蛋白，是一個(gè)相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。本文發(fā)現(xiàn)了一種稱為“RING-Bait”的治療策略，RING是TRIM21蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，用來(lái)標(biāo)記“垃圾”蛋白，并將其交由細(xì)胞的“垃圾處理工廠”蛋白酶體進(jìn)行降解。Bait就是聚合蛋白的單體序列。RING-Bait融合蛋白與聚集蛋白序列結(jié)合，被募集到聚集體中，從而導(dǎo)致聚集體被蛋白酶體降解。RING-Bait可以特異性降解tau聚集體的同時(shí)保留可溶性 tau。
圖1. RING-Bait示意圖：RING-Bait作為tau聚集體的“木馬”分子，介導(dǎo)tau聚集體的降解
本文使用了穩(wěn)定表達(dá)與綠色熒光蛋白融合的 P301S 0N4R tau（病理突變的tau蛋白）的HEK293細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱“TV 細(xì)胞”）。先前研究表明，在轉(zhuǎn)染試劑作用下，TV細(xì)胞通過(guò)形成大而明亮的tau亮點(diǎn)狀來(lái)響應(yīng)外源供應(yīng)的tau聚集體。可以通過(guò)Incucyte®實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)來(lái)追蹤tau 聚集體的生成（圖2，3）。
圖2. Incucyte®系統(tǒng)對(duì)tau 聚集體的亮點(diǎn)狀進(jìn)行圈描，并對(duì)其總面積進(jìn)行計(jì)算（上圖為原圖，下圖黃色區(qū)域?yàn)閠au 聚集體的圈描）
圖3. TV 細(xì)胞在 Incucyte®系統(tǒng)中拍攝72小時(shí)，每2-4小時(shí)拍攝一次照片并進(jìn)行分析。左圖為實(shí)時(shí)統(tǒng)計(jì)的tau聚集體面積，發(fā)現(xiàn)tau-RING可以減少tau的聚集；右圖為終點(diǎn)計(jì)算結(jié)果
為了測(cè)試tau-RING是否依賴于泛素-蛋白酶體途徑（UPS），及與內(nèi)源性TRIM21相同的方式降解聚集體，加入E1 泛素激活酶抑制劑（TAK-243）、VCP抑制劑（NMS-873）和蛋白酶體抑制劑（MG-132）。這些抑制劑完全阻止了 tau-RING 介導(dǎo)的 TVA細(xì)胞tau聚集體降解，表明泛素化途徑是必不可少的（圖4）。
圖4. Incucyte®測(cè)試發(fā)現(xiàn)加入泛素-蛋白酶體途徑相關(guān)抑制劑，tau-RING對(duì)tau聚集體降解被阻止
為了達(dá)到RING-Bait序列的最佳效率，bait（誘餌）和基材（聚合蛋白單體序列）需要在結(jié)構(gòu)上兼容，以便將誘餌有效地?fù)饺肽繕?biāo)聚集體中。在人類tau蛋白病中，不同疾病中的細(xì)絲由不同的tau亞型組成。在家族性tau蛋白病中，WT tau與突變tau的整合是突變依賴性的。因此探索了WT 0N4R tau-RING 在去除攜帶 P301S 突變聚集體的功效。WT 0N4R tau-RING 在降解 TVA 細(xì)胞中的聚集體方面不如 P301S 0N4R tau-RING 有效（圖5）。這表明P301S 突變的 tau與WT tau自聚的效率比較低。
圖5. Incucyte®測(cè)試發(fā)現(xiàn)WT 0N4R tau-RING 在降解 TVA細(xì)胞中的聚集體方面不如 P301S 0N4R tau-RING 有效
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，RING-Bait 去除了從阿爾茨海默病（AD）和進(jìn)行性核上性麻痹（PSP）腦提取物中播種的 tau 聚集體，并延長(zhǎng)了其存活時(shí)間。RING-Bait 策略可以通過(guò)替換 Bait 序列以匹配目標(biāo)聚集體來(lái)應(yīng)用于其他神經(jīng)退行性疾病的治療。
02
可能的下一代腫瘤免疫新療法[2]
線粒體丟失和功能障礙會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭，這是基于T細(xì)胞的免疫療法成功的主要障礙。本文發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞與T細(xì)胞建立納米管連接，并利用這些細(xì)胞間高速公路將基質(zhì)細(xì)胞線粒體移植到CD8 T細(xì)胞中。這些捐獻(xiàn)線粒體的T細(xì)胞擴(kuò)增更穩(wěn)健，浸潤(rùn)腫瘤的效率更高，并且與不吸收線粒體的T細(xì)胞相比，表現(xiàn)出更少的耗竭跡象和增強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)。
為了評(píng)估線粒體轉(zhuǎn)移是否也能提高人抗腫瘤 T 細(xì)胞療效，研究使用Incucyte®評(píng)估了 CD19-CAR T細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記的 NALM6（一種侵襲性 CD19 人 B 細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系）的細(xì)胞毒能力。與 Mito-細(xì)胞（未注入線粒體）的T細(xì)胞相比，Mito+細(xì)胞（注入線粒體）的T細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增加的腫瘤殺傷能力，線粒體功能失調(diào)的T細(xì)胞（Mito EtBr）并沒有增強(qiáng)抗腫瘤活性，證明在Mito+ T細(xì)胞的功能是由供體線粒體驅(qū)動(dòng)的（圖6A）。
為了確定線粒體轉(zhuǎn)移是否賦予 CD19-CAR T 細(xì)胞對(duì)耗竭的抵抗力，評(píng)估了線粒體細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞重復(fù)攻擊下殺死 NALM6 細(xì)胞的能力。Mito+細(xì)胞在六輪刺激中保持對(duì)癌細(xì)胞的強(qiáng)大細(xì)胞毒活性，而 Mito-細(xì)胞在第三輪開始失去殺傷能力，到第六輪幾乎完全耗盡了功能（圖6B，6C）。
圖6. Incucyte®系統(tǒng)每 2 小時(shí)測(cè)量一次腫瘤細(xì)胞的 GFP 熒光強(qiáng)度，共拍攝48-72小時(shí)；B為六輪殺傷結(jié)果，C為終點(diǎn)信號(hào)的拍攝的結(jié)果（腫瘤球）
移植健康線粒體的能力可能與 TIL（腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞）應(yīng)用特別相關(guān)，因?yàn)樗鼈兊膬?nèi)源性線粒體經(jīng)常被腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的敵對(duì)條件造成不可修復(fù)的損害。當(dāng)用 SK23-GFP（一種表達(dá)靶抗原 MART-1 的黑色素瘤細(xì)胞系）和Mito- TIL或Mito+共培養(yǎng)。Mito+TILs介導(dǎo)的腫瘤清除率更高（圖7）。為了探索供體線粒體是否也可以來(lái)自原代 BMSC（骨髓基質(zhì)細(xì)胞），將 MART-1 TIL 與來(lái)自三個(gè)不同供體產(chǎn)生的臨床級(jí)原代 BMSCs 共培養(yǎng)。Mito+ TILs 始終表現(xiàn)出對(duì)增強(qiáng)的靶癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性 。
圖7. 使用Incuyte®對(duì)Mito+和Mito-的TIL對(duì)SK1-GFP黑色素瘤的細(xì)胞毒性測(cè)定。（E：T比例1：5）。供體線粒體來(lái)源于永生化（I）或原代BMSC（J）
這些發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移確立為細(xì)胞器醫(yī)學(xué)的原型，為下一代細(xì)胞療法開辟了途徑。
這些文章看中了
Incucyte®哪些優(yōu)點(diǎn)呢？
培養(yǎng)箱內(nèi)可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過(guò)多操作對(duì)細(xì)胞的傷害和移動(dòng)；如第二篇文章就測(cè)試了6輪免疫細(xì)胞殺傷，耗時(shí)2周左右
多個(gè)板位，分別獨(dú)立設(shè)置檢測(cè)程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高；如第一篇文章就利用Incucyte®的高通量測(cè)試了多種抑制劑的影響
具有劃痕，腫瘤球，類器官，趨化，血管生成等多個(gè)分析拍攝模塊，并配套相應(yīng)的耗材；如第二篇文章使用了腫瘤球模式層掃拍攝
高效簡(jiǎn)便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長(zhǎng)曲線等多指標(biāo)多參數(shù)；捕捉細(xì)胞每個(gè)細(xì)節(jié)，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確
大于100種優(yōu)化過(guò)的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol
文章數(shù)大于16,000篇，認(rèn)可度高
只需放好您的細(xì)胞，
其他交給Incucyte®吧！
祝愿大家都能用Incucyte®發(fā)好文章！
Incucyte®長(zhǎng)時(shí)程活細(xì)成像系統(tǒng)應(yīng)用文集
為了將Incucyte®推廣到更多的活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，我們致力于提供全面的應(yīng)用解決方案。《Incucyte®長(zhǎng)時(shí)程活細(xì)胞成像系統(tǒng)應(yīng)用文集》除了基礎(chǔ)的細(xì)胞增殖和活性監(jiān)測(cè)外（如細(xì)胞凋亡/周期/毒性等），還涵蓋了抗體內(nèi)化、旁觀者效應(yīng)、共培養(yǎng)殺傷、炎癥反應(yīng)（NETosis）、細(xì)胞吞噬、劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞趨化、類器官研究、腫瘤球分析、神經(jīng)突生長(zhǎng)、ATP 檢測(cè)、線粒體膜電位、病毒/脂質(zhì)體/外泌體監(jiān)測(cè)、全孔成像等多個(gè)方面。應(yīng)用范圍廣，是您尋找實(shí)驗(yàn)方法的有利工具。
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-參考文獻(xiàn)-
[1] Co-opting templated aggregation to degrade pathogenic tau assemblies and improve motor function.cell
[2] Intercellular nanotube-mediated mitochondrial transfer enhances T cell metabolic fitness and antitumor efficacy.cell
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