| 國外醫學計劃生育分冊2000年2月第19卷第1期 重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科（400046） 審校 摘要 胚胎著床過程的調節十分復雜，近年來細胞生長因子參與胚胎發育和著床的功能研究十分熱門，在細胞生長因子發揮作用的網絡中，表皮生長因子起著舉足輕重的作用，是著床過程順利完成*的因子之一。本文就表皮生長因子改善胚胎發育、啟動胚胎著床、調節植入過程等內容進行簡要綜述。 關鍵詞：表皮生長因子 胚胎 發育 著床 自1962年Cohen從雄鼠頜下腺分離提純出表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）以來，已證明EGF對多種組織來源的細胞增殖具有明顯的促進作用。除頜下腺以外，人體的多種組織也EGF分布，如：十二指腸的Brnners腺、含中性粘蛋白的胃粘膜細胞系、外分泌腺體以及多種腫瘤細胞等。EGF還常見于包括精液、羊水在內的正常體液中。已經證實，在子宮內膜、蛻膜、著床前胚胎、滋養層細胞等生殖組織中存在EGF和/或EGF受體（EGF-R），EGF通過自分泌、旁分泌和內分泌途徑，單獨或通過細胞因子網絡（cytokine net），參與內膜準備、胚胎發育、植入過程、妊娠維持、胎盤激素合成分泌等生理過程的調節[1～3]。 一、表皮生長因子及其受體 小鼠EGF是一種含53個氨基酸的單鏈多肽，編碼小鼠EGF的信使核糖核酸（mRNA）含4 800對堿基，翻譯出的EGF前體有1217個氨基酸殘基，含數個糖基位點，與低密度脂蛋白（LDL）序列相似，因而EGF前體可能是一種有受體功能的膜糖蛋白。成熟的EGF分子內含3個二硫鍵，活性中心位于48～53個氨基酸殘基之間，分子量為6.045kd，等電點4.6，耐熱及耐胰蛋白酶、糜蛋白酶。不同種類的EGF雖然氨基酸數量和排列有差別，但存在一定的交叉反應。，人EGF從尿液中提取出來時，稱作尿抑胃素（urogastrine），其生物學活性及氨基酸序列與小鼠EGF相似。 EGF-R是一種糖蛋白，廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞，是一條被質膜分為內、外兩個區段的單一多肽鏈。EGF-R含1186個氨基酸殘基，分子量170kd，富含甘露糖。人的EGF-R基因位于第7號染色體短臂上。除細胞膜外，核內也EGF-R分布，二者具有相同的抗原性。EGF-R的結構和功能在不同種屬動物中基本相似，分子進化較保守。EGF-R本身具有蛋白激酶的活性，與配體的結合具有特異性、高親和性等特點[1]。EGF-R在胎盤的分布比在子宮內膜、蛻膜等處要高1000倍，而且主要分布于合體滋養層[4]。 EGF家族的成員為數不少，由于它們的受體相同，因此或多或少地參與了胚胎的發育和著床的過程，研究較為廣泛而深入的是EGF，其次是轉化生長因子（TFG）和肝素結合表皮生長因子（HB-EGF），Amphiregulin、Cripto、Betacellulin、 neu以及Epiregulin與著床的調節只有少量報道[5]。 二、EGF與早期胚胎發展 著床的先決條件是胚胎的正常發育和脫透明帶。Morita[6]用EGF處理體外培養的胚泡，然后移植入同步發情、處于假孕第4d受體母鼠的子宮內，結果著床率為77.9%，與在體內胚泡的發育接近，為84.2%，而體外培養未加EGF有胚泡，移植后的著床率只有57.1%。其原因可能是EGF顯著刺激小鼠胚泡滋養層細胞的外延生長，增加與子宮內膜的粘附。Taga[7]1992年的實驗顯示，EGF對小鼠2細胞的發育不表現出明顯的效應，只在桑椹胚以后，EGF自分泌和旁分泌才對胚胎的發育起作用。然而Buyalos[8]發現，將小鼠2細胞胚胎培養在EGF含量為2～100mg的培養液中，72h后，*擴展和正在孵化的胚泡的比例明顯高于對照組，且EGF的促進作用可被抗EGF抗體所阻斷。Terual[9]將小鼠2細胞胚胎單獨培養時，EGF可明顯增加胚胎的分化生長速率，證明EGF對小鼠2細胞胚胎的生長有促進作用。EGF是否作用于早期胚胎取決于胚胎EGF-R的有無及活性，免疫熒光測定出小鼠未受精卵細胞和2細胞胚胎中呈現很弱的EGF-R熒光，4細胞以后各期，熒光逐漸增強。除滋養層細胞外，內細胞團中也EGF-R的表達，RT-PCR測出4細胞后EGF-R mRNA顯著長高，說明從8細胞開始合成的受體蛋白源自胚胎的mRNA，而受精卵和2細胞胚胎內的mRNA則可能是母源性的[10]。 Merriman[11]將未受精的小鼠卵細胞在EGF的培養液中進行成熟處理，受精后分裂至2細胞階段的能力高于對照組，將這些2細胞胚胎移植人受體假孕小鼠后，著床率為64%～78%，略低于正常著床率89%。Grupen[12]用EGF處理豬的卵細胞，發現能提高進行減數分裂的成熟卵細胞的比例，源于這些卵細胞受精后囊胚的形成率比對照組高，此結果表明，EGF對豬卵細胞的減數分裂和細胞質成熟具有重要作用。 EGF不僅對小鼠，而且在多種哺乳動物中都表現出對著床前胚胎發育具有調節作用。Johnson[13]證實在大鼠妊娠4、5、6d的子宮腺上皮中存在EGF、TGF-α和EGF-R，EGF-R同時還存在于正在植入的胚胎和子宮基質的蛻膜細胞上。Gharib[4]在綿羊圍著床期滋養層細胞上也發現EGF-R存在，其分子量與小鼠EGF-R相同，為170kd，EGF和EGF-R的存在提示EGF參與了調節胚胎的發育。Zhang[15]從著床前的豬胚胎上同樣發現分子量為170kd的EGF-R，該受體蛋白在有EGF和ATP時發生磷酸化。此外，在兔[16]、牛[17，18]、貓[19]、馬[20]等動物的滋養層細胞和子宮內膜上都證實有EGF和EGF-R，EGF能夠刺激體外培養胚胎的卵裂，使之更快發育至囊胚期。停滯發育（arrested development）是斑點鼬（一種小型食肉目哺乳動物）生殖生理的奇特表現，即胚胎著床前要經歷180～220d的“休眠”，Paria[21]運用放射自顯影技術顯示，在斑點鼬子宮腺上皮、內膜基質、肌層和血管上存在EGF結合位點，進步用Northern雜交表明，延緩著床和圍著床期間子宮和胚泡上均有類似于小鼠的EGF-R，分子量也為170kd的受體蛋白。用EGF分子誘導，僅在胚胎“蘇醒”恢復發育時，EGF誘導的蛋白酪氨酸激酶（PTK）的活性才顯著升高，在停滯發育時期，PTK活性無變化。這些結果表明，EGF在斑點鼬的胚胎發育調節中起著重要作用，特別是EGF-R的數量或功能狀態可能是胚胎被激活以及著床的先決條件。 三、EGF與著床啟動 在正常生理過程中，雌激素的第二次峰值對于胚胎著床的開始是必需的。Johnson通過切除大鼠垂體，同時給與孕酮支持建立胚胎延緩著床模型[13]，在這個模型中，由于缺乏雌激素，胚胎無法著床，但當給這些大鼠靜脈注射100mgEGF，同時移植人延緩著床胚胎時，約有73%的大鼠子宮內發現了著床點，EGF雖然能夠啟動著床，但在體內是否參與雌激素的誘導著床作用以及作用方式如何尚不明確。Johnson[22]在另外一個實驗中發現，如果在注射EGF1h前先給與消炎痛（indomethacin，一種前列腺素合成酶的抑制劑），EGF啟動著床的作用可被阻斷，但對雌二醇的作用則無影響，這個結果一方面說明EGF、雌二醇啟動著床的途徑可能不同；另一方面提示前列腺素參與調節著床過程。Tamada[23]測定了EGF對大鼠胚泡著床和蛻膜反應的影響作用。結果表明，在延緩著床大鼠的子宮腔內注射EGF，所誘導的著床效果與EGF呈劑量依賴關系，假孕5d的大鼠接受EGF宮腔注射后，蛻膜反應增強，提示EGF在胚胎著床和蛻膜化過程中可能發揮重要作用。EGF和雌二醇不同的啟動著床途徑在Chatterjee[24]的實驗中得以驗證，作者在用提純的雌激素拮抗劑ICI-182780阻斷雌二醇啟動著床的效應時，卻發現該拮抗劑并不影響EGF。 四、EGF與胚胎植入 1992年Hofmann[25]應用免疫組化方法證實人胚植人部位EGF和EGF-R，而且報道中間型滋養層（intermediaet rtophoblast,IT）也EGF和EGF-R分布，從而為EGF在人體早期妊娠胚胎植入過程具有調節作用提供了依據。EGF、EGF-R在滋養層的免疫活性表現呈下列規律：合體滋養層＞中間型滋養層＞細胞滋養層，分布差異的原因尚不明了。 有胚胎粘附、侵蝕、穿透子宮內膜過程中，子宮內膜細胞的凋亡涉及一系列蛋白酶的作用，如：細胞滋養層細胞（CTB）分泌的基質金屬蛋白酶（MMP），它能消化內膜的細胞外基質；與之對抗的是蛻膜產生其抑制劑TIMPs；子宮內膜入滋養層還分泌一種調節酶劑，即纖溶酶原激活因子（PA，主要是尿激酶型uPA）。Harvey[26]在小鼠著床前和著床期子宮內膜中都測出TIMPs（1，2，3）和uPA受體有轉錄，但只在處于植入侵蝕階段的胚胎中才*次測出MMP-9和uPA的mRNA，原位雜交顯示MMP-9于7.5d時植入胚胎周圍的滋養層細胞高表達，而TIMPs則于緊鄰植入胚胎周圍的蛻膜中高表達，TGF-β1刺激TIMPs的產生。uPA主要表達于外胎盤錐，這樣的表達方式保證胚胎地植入。Harvey的實驗證明，EGF對這些酶的活性具有調節作用。他將妊娠4d的小鼠胚胎培養在含EGF的培養液中，2d后，其MMP-9和uPA的活性增強；白血病抑制因子（LIF）具有同樣效應，但從第3d起，EGF失去刺激效應，LIF甚至抑制MMP-9和uPA的生成，此結果說明EGF與LIF一起參與了植入過程中蛋白激酶表達正確程序的建立。Miyauchi[27]進一步證實，EGF對uPA釋放的刺激作用，同時還發現EGF刺激人體內膜細胞釋放組織型PA（tPA）以及PA的抑制劑PAI-1，EGF對tPA和PAI-1釋放的刺激作用在有孕酮存在時得以增強，推導EGF同孕酮一樣參與著床，部分地通過調節纖溶酶原激活因子/纖溶酶系統來完成內膜組織凋亡、重建和細胞遷移。EGF啟動著床的作用被消炎痛阻斷這一現象提示，前列腺素可能是其發揮作用的環節之一，而前列腺素本身又是調節著床的重要因素之一，它可直接增加蛻膜細胞中uPA的轉錄和表達，調節細胞外基質[28]，同時刺激著床部位內膜毛細血管通透性增加，多種營養物質進入該部位，使得內膜疏松水腫而有利于著床。至于EGF與前列腺素相互作用關系還有待探明。zui近發現[29]，通過蛋白激酶C途徑磷酸化cAMP應答元件結合蛋白（cAMP response element-binding protein,CREB）,EGF能促進滋養層細胞中人絨毛膜促性腺激素-α（hCG-α）基因的轉錄，而hCG對胚胎著床具有十分重要的意義。 胚泡粘附、植入時，同類因子中zui早發揮直接作用的可能是HB-EGF[30]。表達于內膜上皮的HB-EGF可與細胞表面的兩個位點結合：一是胚泡或滋養層細胞的EGF-R；二是滋養層細胞的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）。小鼠胚泡粘附一般發生在妊娠第4d晚上10點～11點，此前6～7h，HB-EGF開始表達。體外研究顯示，HB-EGF可使胚泡的EGF-R去磷酸化，從而促進胚泡生長、透明帶孵化以及滋養層的擴展生長。 五、EGF的調節 EGF是細胞生長因子網絡中眾多成員的一員，其功能既受因子之間、各種激素等活性物質的調節，又有其自身的旁分泌和自分泌調節，機制十分復雜，至今尚未*明了。比較統一的觀點是，EGF主要受到雌激素的調控。Kleinstein[31]用放射性配體結合法在兔和人的研究中發現，雌激素能夠促進植入前子宮內膜表達EGF-R，雌激素拮抗劑可以阻斷這種誘導效應，而孕酮并不影響標記EGF結合到內膜表面。不僅如此，小鼠胚泡中EGF-R基因的表達與母體雌激素狀態密切相關，Paria[32]在小鼠妊娠第4d時切除其卵巢，以后每天（5～7d）注射孕酮，從而建立起延緩著床模型，第7d時，注射雌二醇，結果激活胚泡并發生著床。原位雜交技術可從正常妊娠D4胚泡中測出EGF-R的mRNA，但在休眠胚泡中檢測不出。休眠胚泡在注射雌二醇8h后被激活，用半定量RT-PCR法測定，EGF-R的mRNA拷貝數增加了8倍。以上實驗表明，雌激素對EGF和EGF-R的表達具有重要的調節作用。至于雌激素拮抗劑ICI-182780不影響EGF啟動著床的原因，分析是雌激素與EGF發揮調節胚胎著床的作用層次和/或途徑不一所致，雌激素可能通過多種途徑參與調節胚胎著床，而EGF可能是這些途徑中比較重要的一環。 EGF主要表達于子宮內膜，而EGF-R在內膜和胚泡（包括滋養層細胞）均有表達，但是在小鼠，EGF-R主要表達于子宮內膜的基質和肌層，在內膜上皮中，RT-PCR法未測到完整的mRNA分子，只測出轉錄分子的片段，這些片段不能翻譯出有功能的EGF-R，而在著床前的囊胚中，完整的EGF-RmRNA十分豐富，由此提示，在胚胎——子宮內膜相互作用中，包括EGF、HB-EGF、TGF-α等EGF家庭成員的作用對象是胚泡，而不是子宮內膜上皮。 六、其它 Amphiregulin（Ar）、Cripto等生長因子與著床關系的研究始于近幾年，報道的文獻十分有限。Johnson[34]從未受精的小鼠卵細胞和早期胚胎未測出Ar的存在。Tsark[35]用多克隆抗Ar抗體和間接免疫熒光技術從桑椹胚和囊胚中測到Ar，Ar分布于胚胎細胞的胞質和核內，具有使胚胎加快進入囊胚階段，同時增加胚胎的細胞數目的功能，TGF-α也可提高囊胚的形成，但不影響細胞數目，結果提示Ar以自分泌方式作用于小鼠著床前胚胎，其刺激細胞增殖、促進囊胚盡早形成的能力大于TGF-α。同樣，Cripto的轉錄只在囊胚期才見到[35]，主要定位表達于胚胎的外胚層和隨后快速生長的外胎盤錐。Xu[36]進一步發現，Cripto從囊胚期開始，逐漸表達于原條和心臟發生的部位，它對具有收縮性的心肌細胞分裂和分化的效應。Reese[5]證實，NDF表達于植入胚胎周圍的子宮內膜中，在延緩著床的小鼠模型中，NDF不表達，而當注射雌激素、激活胚胎著床時，NDF很快恢復表達功能，此結果提示，NDF可能參與胚胎與內膜復雜的信號傳遞途徑，對胚胎的激活是必要的。 七、結束語 EGF雖然在著床過程中表現出多種形式的功能，但就調節著床的因素而言，EGF的功能并不如雌激素、孕激素，甚至LIF、IL-1等因子更重要，研究EGF與著床的關系只是闡明胚胎著床機制中很小的組成部分，至于EGF在體內調節著床的完整功能尚有待人們去研究探討。 *重慶醫科大學醫學超聲工程研究所 參考文獻 1 王宏.國外醫學免疫學分冊，1995；3：146-148 2 Murray JF,Dowing JA,Evans c et al. 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