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25-羥基維生素D檢測試劑盒用于定量檢測人血清中總的25-羥基維生素D含量。

背景簡介：

25-羥基維生素D是激活維持腸內鈣吸收和平衡的一類甾類激素。維生素D 有兩個亞型：維生素D2和維生素D3。維生素D2來源于乳制品，而維生素D3在來源日光照射后的皮膚。在肝臟內維生素D 碳25位置發生羥基化，形成25羥基維生素D。25羥基維生素D是維生素D的主要代謝循環產物，被廣泛認為是反應個體維生素D水平的準確的標記物。多種疾病與維生素缺乏相關：如骨質疏松癥、佝僂病、軟骨病、癌癥以及多種心血管疾病。通過飲食補充的維生素D2和維生素D3都在肝臟中轉化為25-羥基維生素D。血清或血漿中的25羥基維生素D2和D3的總濃度為被認為25羥基維生素D的總量。維生素D缺乏的患者應經常檢測血清或血漿中的25-羥基維生素D含量，通過補充維生素D使維生素D含量達到*水平，同時避免因過量補充維生素D引起維生素D水平超標。

檢測原理：

試劑盒采用競爭ELSIA 檢測方法。包被有維生素D的96孔板與標準品、對照、檢測樣本和生物素標記的維生素D室溫孵育90min。孵育過程中，生物素標記的維生素D與樣品、標準品及質控中的維生素D競爭結合包被的維生素D抗體。洗滌后，通過HRP標記的鏈親合素（SA-HRP）與結合的生物素標記的維生素D反應，連檢測維生素D含量。樣本中的維生素D含量越高，生物素標記的維生素D含量越少。未結合的SA-HRP在被洗掉，加入TMB 室溫孵育30min，有藍色出現。加入終止液，讀取450nm吸光度。用吸光度和和標準品濃度做標準曲線。顏色深淺與25-OH維生素D含量成反比關系。整個過程為2.5小時。

樣本收集和處理

血清樣本-通過靜脈采血，血凝集后，盡快分離血清。請不要用溶血的樣本。

新鮮血清可在2-8℃儲存兩周。長期保存，請在-20℃一下保存，避免反復凍融。測定前，樣本需置于室溫平衡30min。

試劑制備：

檢測前請提前制備以下試劑：

1. 標準品和試劑：

血清為即用型，用前請在室溫平衡。

1. 51X生物素標記：用前稀釋，用稀釋液制備1X工作稀釋液（例如：5ml稀釋液中加入：0.1ml 51X的生物素標記的VitaminD），剩余的稀釋液應置于2-8℃避光，封閉保存。
2. 制備1X洗滌緩沖液：20X稀釋液(25ml)，加入475ml蒸餾水。室溫保存（18-24℃。）

操作程序：

所有的樣本和檢測試劑在用前都需室溫平衡。

1. 標準品，對照，樣本加入10ul到對應孔。
2. 加入200 ul 生物素標記的25-OH維生素到各孔。
3. 振板儀200-400rpm 振板20s，充分混勻。用封板膜封板。
4. 封板后，室溫孵育90min。
5. 去掉封板膜。
6. 倒掉孔內液體。
7. 洗滌：加入300ul1X洗滌緩沖液到各孔，然后倒掉，在吸水紙上拍干。重復洗滌三次。
8. 加入200ul Streptavdin-HRP到各孔。
9. 室溫孵育30min。
10. 倒掉孔內液體。
11. 洗滌：加入300ul1X洗滌緩沖液到各孔，然后倒掉，在吸水紙上拍干。重復洗滌三次。
12. 用排槍加入：200ul TMB到各孔。
13. 室溫避光孵育30min。
14. 終止：加入50ul終止液終止反應。輕輕混勻20-30s。
15. 加入終止液10分鐘內，讀取450nm吸光度。