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Agilent 1100 LC現(xiàn)場培訓(xùn)教材
閱讀：2881 發(fā)布時間：2013-6-13
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| Agilent 1100 LC現(xiàn)場培訓(xùn)教材 |
| 一、培訓(xùn)目的： ● 基本了解1100LC硬件操作。 ● 掌握化學(xué)工作站的開機，關(guān)機，參數(shù)設(shè)定,學(xué)會數(shù)據(jù)采集,數(shù)據(jù)分析的基本操作。 二、培訓(xùn)準(zhǔn)備： 1、儀器設(shè)備： Agilent 1100LC ● G1310A :（單元泵）；G1312A（二元泵）；G1311A（四元泵）。 ● G1313A（自動進(jìn)樣器）。 ● G1316A（柱溫箱）。 ● G1314A（VWD檢測器）。 ● G1362A（示差檢測器）。 ● G131/B （DAD檢測器）。 ● G1321A （FLD檢測器）。 ● 色譜柱: Zorbax eclipse XDB C8,150mm×4.6mm i.d。 2、溶劑準(zhǔn)備： ● 色譜級純或優(yōu)級純乙腈（ACN）或甲醇。 ● 二次蒸餾水 基本操作步驟: （一）、開機： 1、打開計算機,進(jìn)入Windows NT （或Windows 2000）畫面,并運行Bootp Server程序。 2、打開 1100 LC 各模塊電源。 3、待各模塊自檢完成后，雙擊Instrument 1 Online圖標(biāo)，化學(xué)工作站自動與1100LC通訊，進(jìn)入的工作站畫面如下所示。 4、從“View”菜單中選擇“Method and Run control”畫面, 單擊”View”菜單中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”標(biāo)志，來調(diào)用所需的界面。 5、把流動相放入溶劑瓶中。 6、打開Purge閥。 7、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項，進(jìn)入泵編輯畫面。 8 、設(shè)Flow：5ml/min，單擊OK。 9、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump control選項，選中On，單擊OK，則系統(tǒng)開始Purge，直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止,切換通道繼續(xù)Purge，直到所有要用通道無氣泡為止。 10、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump Control選項，選中Off，單擊Ok關(guān)泵，關(guān)閉 Purge valve。 11、單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項，進(jìn)入Pump編輯畫面，設(shè)Flow：1.0ml/min。 12、單擊泵下面的瓶圖標(biāo)，如圖所示（以二元泵為例），輸入溶劑的實際體積和瓶體積。也可輸入停泵的體積。單擊Ok。 （二）數(shù)據(jù)采集方法編輯： 1、開始編輯完整方法： ● 從“Method”菜單中選擇“Edit entire method” 項，如上圖所示選中除“Data analysis ”外的三項，單擊Ok，進(jìn)入下一畫面。 2、方法信息： ● 在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。 ● 單擊Ok 進(jìn)入下一畫面。 3、泵參數(shù)設(shè)定：（以二元泵為例） ● 在“Flow”處輸入流量,如1ml/min，在“Solvent B”處輸入70.0,（A=100-B） ,也可Insert 一行”Timetable” ,編輯梯度。在“Pressure Limits Max”處輸入柱子的zui大耐高壓，以保護(hù)柱子。 ● 單擊Ok進(jìn)入下一畫面。 4、自動進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)定: ● 選擇合適的進(jìn)樣方式, 如圖所示，進(jìn)樣體積 1.0ul ,洗瓶位置為6號。“Standard Injection”----只能輸入進(jìn)樣體積，此方式無洗針功能。“Injection with Needle Wash”----可以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會在洗瓶中洗針。“Use injector program”---可以點擊Edit 鍵進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯。 ● 點擊Ok進(jìn)入下一畫面。 5、柱溫箱參數(shù)設(shè)定: ● 在”Temperature”下面的方框內(nèi)輸入所需溫度,并選中它,點擊”more>>” 鍵,如圖所示,選中”Same as left”---使柱溫箱的溫度左右一致。 ● 點擊ok進(jìn)入下一畫面。 6、VWD檢測器參數(shù)設(shè)定: ● 在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm, 在”Peak width （Response time）”下方點擊下拉式三角框,選擇合適的響應(yīng)時間, 如>0.1min （2s）。 ● 在Timetable 中可以“Insert”一行，輸入隨時間切換的波長，如1min ，波長=300nm。點擊ok進(jìn)入下一畫面。 7、DAD檢測器參數(shù)設(shè)定: ● 檢測波長: 254nm,BW=30nm, 參比波長=350nm,BW=100nm; ● 檢測波長：一般選擇zui大吸收處的波長。樣品帶寬BW：一般選擇zui大吸收值一半處的整個寬度。參比波長：一般選擇在靠近樣品信號的無吸收或低吸收區(qū)域。參比帶寬BW：至少要與樣品信號的帶寬相等，許多情況下用100nm作為缺省值。Peak width（Response time）：其值盡可能接近要測的窄峰峰寬。Slit—狹縫窄，光譜分辨率高；寬時，噪音低。同時可以輸入采集光譜方式，步長，范圍，閾值。選中所用的燈。 ● 點擊Ok進(jìn)入下一畫面。 8、 RID檢測器參數(shù)設(shè)定: ● 色譜條件: 進(jìn)樣體積: 20ul。 光學(xué)單元溫度: Off 。 極性: 正。 峰寬（響應(yīng)時間） : 4s 。 ● 如圖所示: “Optical Unit Temperature”---若環(huán)境溫度控制在±2℃,設(shè)定為Off, 若環(huán)境溫度不穩(wěn)定,則設(shè)定光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5度,以防樣品在池中沉淀。“Peak width”---大多數(shù)分析設(shè)為4S，只有在高速分析下設(shè)為更短。“Automatic recycling after analysis”---在不進(jìn)行分析時可以讓流動相循環(huán)，節(jié)省流動相，檢測器連續(xù)運行，可隨時投入使用。 ● ***** 點擊RID圖標(biāo)，選擇RID Control ：Heater 設(shè)為On，若要循環(huán)流動相，必須將“Recycling Valve”設(shè)為ON。手動purge 參比池，將其設(shè)為On，并輸入Purge 時間。 9、 FLD檢測器參數(shù)設(shè)定: 色譜條件： ● 樣品：P/N 01018-68704 用甲醇稀釋為1:10。 ● 進(jìn)樣體積：5ul。 ● 柱溫箱: 30℃。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 ● 響應(yīng)時間=4s. 停止時間：出峰完畢。 ● Excitation A: 激發(fā)波長:200-700nm,步長為1nm,或Zero Order。 ● Emission: 發(fā)射波長: 280-900nm, 步長為1nm,或Zero Order。 ● PMT: 大多數(shù)應(yīng)用適當(dāng)?shù)脑O(shè)定值為10,若高濃度樣品峰被切平頭,則減少 PMT 值。 ● “Peak width”：大多數(shù)應(yīng)用設(shè)為4s，只有快速分析采用小的設(shè)定值。 ● Multi Ex ：多波長及光譜（激發(fā)）。 ● Multi Em：多波長及光譜（發(fā)射）。 ● 同時可以輸入范圍Range、步長step、采集光譜。 10、在“ Run time checklist ”中選中“Data acquisition”，單擊Ok。 11、單擊“Method”菜單，選中“Save method as”，輸入一方法名，如“test”，單擊Ok。 12、從菜單 “View”中選中”Online signal” ,選中Windows 1,然后單擊Change 鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中,點擊Ok.（如同時檢測二個信號,則重復(fù)12,選中 Windows 2）。 13、從“Run control ”菜單中選擇“Sample info”選項，如上圖所示，輸入操作者名稱，在“Data file ”中選擇“Manual”或“Prefix”。 區(qū)別: Manual--每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會將上次的數(shù)據(jù)覆蓋掉。 Prefix—在Prefix 框中輸入前綴，在Counter 框中輸入計數(shù)器的起始位，儀器會自動命名，如vwd0001，vwd0002……。 14、從Instrument 菜單選擇System on。 15、等儀器Ready，基線平穩(wěn)，從Method菜單中選擇“Run method”，進(jìn)樣。（DAD, VWD色譜圖如下所示：） （三）、數(shù)據(jù)分析方法編輯: 1、從“View”菜單中，單擊“Data analysis”進(jìn)入數(shù)據(jù)分析畫面。 2、從“File”菜單選擇“Load signal”，選中您的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示。單擊Ok。 3、做譜圖優(yōu)化,從“Graphics”菜單中選擇“Signal options”選項，。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時間，單擊ok,或選擇”Use Ranges” 調(diào)整。反復(fù)進(jìn)行，直到圖的比例合適為止。 4、積分: （1）、從“Integration”中選擇 “Auto integrate”,如積分結(jié)果不理想,再從菜單中選擇“Integration Events”選項，選擇合適的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。 （2）、從“Integration”菜單中選擇“Integrate”選項，則數(shù)據(jù)被積分。 （3）、如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿意為止。 （4）、單擊左邊“√”圖標(biāo)，將積分參數(shù)存入方法。 5、打印報告: （1）、從“Report”菜單中選擇“Specify report”選項，進(jìn)入如上畫面。 （2）、單擊“Quantitative Results”框中Calculate右側(cè)的黑三角，選中Percent（面積百分比），其它選項不變。 （3）、單擊Ok. （4）、從“Report”菜單中選擇“Print report”，則報告結(jié)果將打印到屏幕上，如想輸出到打印機上，則單擊Report 底部的“Print”鈕。 （四）、關(guān)機: ● 關(guān)機前，用 100%的水沖洗系統(tǒng)20分鐘，然后用有機溶劑沖洗系統(tǒng)10分鐘（如ACN），然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱）。[正相色譜柱用適當(dāng)?shù)娜軇_洗] ● 退出化學(xué)工作站，及其它窗口，關(guān)閉計算機（用shut down關(guān)）。 ● 關(guān)掉Agilent 1100電源開關(guān)。 （五）、Agilent 1100 LC維護(hù)保養(yǎng)： 1、色譜柱長時間不用，存放時，柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑，兩端封死（如ACN適于反相色譜柱，正相色譜柱用相應(yīng)的有機相） 2、對于手動進(jìn)樣器，當(dāng)使用緩沖溶液時，要用水沖洗進(jìn)樣口，同時搬動進(jìn)樣閥數(shù)次，每次數(shù)毫升。 *3、流動相使用前必須過濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長菌）。 *4、帶seal-wash的 1100，要配制90%水+10%異丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶劑不能干涸。 5、其它主意事項見說明書，或由現(xiàn)場工程師介紹。 維護(hù)知識問答 1、為什么溶劑和樣品要過濾? 溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對分析結(jié)果的影響。 色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。 儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。 樣品過濾頭的類型： 30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.2μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50μl。 13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料為纖維素。 3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.2μm和0.45μm兩種規(guī)格。處理樣品體積為7μl。 濾膜類型： 聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。 醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。 尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。 再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機溶劑。 2、為什么HPLC用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項？ HPLC用緩沖鹽時,由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的細(xì)小鹽粒非常堅硬,它附著在藍(lán)寶石活塞桿上,隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運動,容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1mol時,必須使用該在線沖洗選項. 清洗液配制: 90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。 3、為什么Agilent 1100LC的流動相管路非常細(xì)? 在使用HPLC時,應(yīng)特別注意”柱外效應(yīng)”對分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動相中的擴散系數(shù)比在氣體中小4~5個數(shù)量級，液體流動相的流速也比氣相慢1-2個數(shù)量級。因此，樣品進(jìn)入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之zui小，獲得理想的分析結(jié)果，Agilent 1100LC 使用加工工藝難度高的毛細(xì)管線作為流動相管路。 毛細(xì)管線分類：0.17mm內(nèi)徑 ------綠色 ;0.12mm內(nèi)徑-------紅色。 PEEK 管線：內(nèi)徑 -----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。 毛細(xì)管線優(yōu)點: 柔韌性好. ***Agilent 公司同時備有1/16in 的粗外徑毛細(xì)管線,適用于不同習(xí)慣的用戶 ,優(yōu)點是剛性好,但柔韌性差一些。 4、流動相使用前為什么要脫氣？ 流動相使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會造成熒光猝滅。 常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。 抽真空脫氣法：易抽走有機相。 超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果zui差。 在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。 5、如何防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？ 溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器，從而影響泵的運行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=4—7）。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞。 A：請嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過濾。 B：請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液 C：如果應(yīng)用許可，可在溶劑中加入0.0001---0.001M的*. D:在溶劑瓶內(nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣,以隔絕空氣。 E：避免使溶劑瓶暴露在直射陽光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。 堵塞后的處理法方法： 將過濾頭從組件中取下，在濃硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸餾水沖洗干凈并超聲處理。 6、 Agilent 1100LC泵如何維護(hù)？ Agilent 1100LC泵給色譜柱提供穩(wěn)定、無脈動、流量準(zhǔn)確的流動相，及時合理的維護(hù)非常重要。 A：流動相使用前請必須脫氣、過濾。 B：使用緩沖鹽時，要加在線Seal-wash選項。 C：關(guān)機前，用 100%的水沖洗系統(tǒng)20分鐘，然后用有機溶劑沖洗系統(tǒng)10分鐘（如甲醇），然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱）。[正相色譜柱用適當(dāng)?shù)娜軇_洗] D：及時更換Purge Valve內(nèi)的過濾芯。（當(dāng)打開Purge Valve時，壓力高于10bar，表明過濾芯已堵）。E：使用合適的密封圈。 7、如何選擇合適的泵頭活塞密封圈？ 泵頭活塞的標(biāo)準(zhǔn)密封圈能適合于大多數(shù)應(yīng)用，但使用正相溶劑（如正己烷），不適合使用標(biāo)準(zhǔn)活塞密封圈，特別是長時間使用時，需更換另一種不同的密封圈，我們建議使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905-1420 2/pk） ***注意：聚四氟乙烯密封圈的壓力范圍為：0—200bar；建議在泵的壓力限制中，將zui大壓力設(shè)為200bar。 8、使用梯度比例發(fā)時要注意那些事項？ 當(dāng)鹽溶液與有機溶劑溶液混合時，鹽溶液能與有機溶劑溶液*混溶，而不會出現(xiàn)沉淀。但是在比例閥的混合點，重力作用使鹽顆粒沉淀下來，通常，閥A接水相/鹽溶液，D接有機溶劑，此法連接可有效使鹽回落到鹽溶液中，并被溶解。若顛倒過來，鹽可能落在有機溶劑中，出現(xiàn)問題。強烈建議：當(dāng)使用緩沖鹽溶液和有機溶劑時，推薦將緩沖鹽通道接在A通道上，有機溶劑通道直接接在A通道的上方D通道上；定期用水沖洗所有的通道，以除去閥口上可能出現(xiàn)的鹽沉淀。 9、在線真空脫氣機使用要注意那些事項？ 一般來說，Agilent 1100LC 的真空脫氣機無需過多維護(hù)，只需注意幾個注意事項就可以了。 A：*次使用，要用隨儀器附帶的注射器抽滿脫氣機腔體；更換不同類型的溶劑時，要先抽空，再抽滿。 B：不用的通道要充滿溶劑或密閉起來。 10、更換色譜柱時要注意什么事項? 在使用HPLC時,應(yīng)特別注意”柱外效應(yīng)”對分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動相中的擴散系數(shù)比在氣體中小4~5個數(shù)量級，液體流動相的流速也比氣相慢1-2個數(shù)量級。因此，樣品進(jìn)入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之zui小，獲得理想的分析結(jié)果，儀器的流動相管路連接非常重要,一般Agilent 1100LC 在*次安裝時,均有受過專業(yè)培訓(xùn)的安裝工程師負(fù)責(zé)安裝,各種接頭會處理的非常。客戶只需在更換色譜柱時注意接頭處理就可以了，一般柱子入口接頭為不銹鋼卡套接頭，柱子出口為不銹鋼卡套接頭或PEEK管線手?jǐn)Q街頭，當(dāng)完成*次安張后，不銹鋼卡套已固定死，當(dāng)接不同的柱子時，要注意柱子接頭處的形狀和長度，否則會產(chǎn)生一個非常大的死體積。 下面是不同廠家柱子接頭的形狀和長度，請參考： 11、手動進(jìn)樣閥需做那些維護(hù)，使用時要注意什么？ 對于手動進(jìn)樣器，當(dāng)使用緩沖溶液后，或者進(jìn)濃度差異比較大的樣品時要用工具而不是用帶針頭的注射器沖洗進(jìn)樣口，同時搬動進(jìn)樣閥數(shù)次，每次數(shù)毫升。 注意事項： ● 安裝時六通閥的5，6出口要與注射器在同一水平線上，以防止虹吸現(xiàn)象的發(fā)生，導(dǎo)致進(jìn)樣量的重復(fù)性變異。 ● 進(jìn)樣量的多少要根據(jù)定量管的LOOP體積決定。 當(dāng)樣品量少時：進(jìn)樣體積由注射器的進(jìn)樣體積決定，但zui大進(jìn)樣體積要小于1/2loop體積。 當(dāng)樣品量較多時：進(jìn)樣體積由定量管的體積決定，為保證樣品*把定量管的流動相置換干凈，需注射5—6倍的LOOP體積。 ● C：要使用的液相注射器進(jìn)樣，不可以用氣相的注射器。 |
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