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毛細管色譜柱的使用技術及常見故障
閱讀：4379 發布時間：2013-6-16
毛細管色譜柱的使用技術及常見故障
1．毛細管的安裝
毛細管柱的安裝常為人們所忽視，往往會出現作填充色譜柱多年的技術人員，剛使用毛細管柱時，做出的色譜圖還不如填充柱的色譜圖，這使人們很難理解。但究其原因，多數是由于毛細管柱的安裝和操作上的毛病，而不是柱子本身和儀器系統的問題。因此，一根好的毛細管柱和設計得很好的色譜系統，還必須使柱子在系統中安裝得合理，才能做出好的結果。
1.1毛細管柱與進樣器的連接對于分流進樣，毛細管柱的入口端一定要伸過分流進樣器的分流出口（圖1A），亦就是使毛細管柱的入口處于載氣的高流速區域。如果毛細管柱的入口在分流進樣器的分流出口以下（圖1B），處于載氣的低流速區域，得到的色譜圖還不如填充柱，所以必須將毛細管的入口伸過分流進樣器的分流出口，這樣才會得到尖銳的峰形。對于分流/不分流進樣，毛細管的入口應接到進樣器的底部（圖1c）這樣可以使汽化管中的樣品*進入柱子，也不會出現氣流清洗不到的“死區”。
圖1A、B、C毛細管柱與進樣器的連接示意圖
1.2毛細管柱與檢測器的連接
在毛細管連接到檢測器之前，先接通載氣，看一下柱子的出口是否有載氣通過，（將柱子出口浸入清水中看是否有氣泡出現）如果沒有載氣從柱子出來，說明柱前的系統中有的地方漏氣或柱子堵塞，應找出原因加以解決。然后將柱子的未端盡可能的伸到檢FID）的噴嘴以下的1~2厘米處（但不能超過噴嘴如圖2 ，并使柱子的出口處于氣流的zui高流速區域（即氫氣引入口以上），如果柱子不能直接伸到檢測器的噴嘴下1~2厘米處，但必須伸到尾吹氣入口的上部使柱子的未端處于氣流的高速區域。
圖2 毛細管柱與檢測器的連接示意圖
1.3分流比的測定與選擇
分流比可以定義：樣品*汽化時與載氣充分混合后，樣品通過分流進樣器進入柱子的流量FC與通過分流器的流量F分流之比：分流比= FC/F分流（式1）有的人把分流比定義為：樣品進入汽化室后，進樣器中總的流速=FC十F 分流與柱流速FC之比：分流=FC/FC +F分流（式2）例如，柱子出口流速為1ml/分，分流器放空的流速為99ml／分，則分流比為100:1 ，因為柱流速FC比分流流速小所以（式1）、（式2）的結果很相近，FC和F 分流可通過皂沫流量計測量。如果載氣通過毛細管柱的流量很小，用皂沫流量計不容易測，FC也可以通過計算求出： FC= 60uπr2 其中u為載氣的平均線速度，單位厘米／秒。u可以通過進樣后用某物質的保留時間求得，某物質可以用甲烷、甲醇等均可，要求是色譜柱對該物質的吸附要小，一般以甲烷為宜，具體計算方法為：u=柱長（厘米）/保留）分流比及分流有大小靠分流閥進行調節，選擇適當的分流比也很重要。如果分流比很小，樣品大多數進入柱子、容易使峰變寬，形成前伸峰。分流比一般選擇在1:100~200之間，這時樣品的起始組分的譜帶擴展很小，出峰尖銳。對一根0.25mm內徑的毛細管，用N2作載氣，*流速0.3~0.4ml/分，則分流流量調到50ml/分左右即可。在毛細管分流進樣系統中一般以柱頭壓力來恒量柱流量的大小，下表給出一些常用的毛細管柱在標準線速度的情況下的柱頭壓力：
上表所使用的載氣為氮氣，線速度為20cm/秒。或氫氣，線速度為40cm/秒。
1.4尾吹氣流量的測量與選擇
毛細管色譜分析用FID檢測器時，一定要加尾吹氣，一般用空氣或N2氣。加尾吹氣的作用之一是減少柱后死體積對色譜峰造成的擴散，之二是保證FID有合適的氮氫比。FID系質量型檢測器，適當地增加尾吹氣可提高檢測的靈敏度（圖3），但尾吹氣太高，會引起基線不穩以至滅火，尾吹氣太低，會引起色譜峰拖尾、對毛細管柱效損失大大。尾吹氣流量一般在20-30ml比較適合，可用皂沫流量計來測量。
圖3尾吹氣流速對峰高的影響
1.5 毛細管柱的老化
涂漬好的毛細管柱首先要經過充分的老化，以除去固定液中的低分子量物質，一般商品毛細管柱，在制造出廠前都已經過充分老化；但柱子一經從儀器上拆卸下來，較長時間接觸空氣，在下一次使用之前，以較低的初始溫度程序升溫至zui高使用溫度老化2—3次。各種固定液因其性質和生產廠家不同而zui高使用溫度有所不同，所以要注意毛細管柱的說明，生產毛細管柱的廠家應注明zui高使用溫度。老化中應注意載氣的流速不易過大，否則會破壞均勻的液膜。一般非極性柱在250℃以下老化使用，可用普通氮氣，在250℃以上高溫使用時，必須使用高純氮氣或普通氮氣經脫氧后使用，以延長柱子的使用壽命。對極性柱，尤其是PEG類（聚乙二醇）、FFAP、含氰基的固定液（OV225、•OV275），一定要用高純氮氣（高純氮氣經過脫氧，）99.99%否則，固定液很快被氧化，以致不能使用。
1.6交聯毛細管柱的清洗
交聯毛細管柱zui重要的優點是當柱被可溶性有機重組分污時，可以用溶劑清洗除去污染物，使柱得以再生，根據污染的性質，可適用非極性溶劑（如正戊烷）或極性浴劑（如二氯甲烷、丙酮、苯等）。每個試驗室都可以做一簡單設備，如（圖4）來進行清洗。清洗方法：將溶劑裝入小瓶的2/3處，把毛細管的出口端（接檢測器的一端）刺過青霉素的橡皮蓋插入溶劑底部。（青霉橡皮蓋較硬，不易被彈性石英毛細管刺透，可用一金屬絲或注射針預先刺透，在留的痕跡處插入石英毛細管）。接著用25ml或50ml的注射針，向小瓶內壓入空氣，溶液即會壓入柱內，直全部溶劑從柱中流出，（如果是20米以上的大口徑毛細管柱，再加一次溶劑清洗） 隨后，將柱從小瓶中拉出與儀器的進樣連接，用載氣將柱中的溶劑吹干后，再把柱的另一端與檢測連接。用程序升溫的方式老化l～2次，即可使用。清洗過程應注意：①溶劑必須用分析純試劑；②溶劑在柱浸泡時間不能過長，以防止固定液液膜溶漲，使柱效下降。
1．25或50ml注射器 2．青霉素小瓶 3．毛細管柱
圖4清洗方法示意圖
1.7毛細管色譜分析中常見故障及排除
1.7.1進樣不出峰
這是zui常見的問題之一，主要原因有以下凡個方面：漏氣：進樣隔墊、柱子兩端的接頭以及放空針形閥前的連接處漏氣?；鹧嫦纾赫{節氫氣或尾吹氣流量的大小，看記錄筆是否向一邊偏移，如筆不動，說明火熄了或火沒點著。電路不正常：離子線、放大器、記錄儀連線接錯或接觸不好，放大器有問題。系統堵塞：在上述情況均正常時應懷疑系統堵塞，樣品沒有進到檢測器，先檢查柱后是否有氣流通過，如果沒有氣流通過，可能柱子堵塞，從柱后折斷1~2厘米，仍不通氣，再檢查柱前是否堵塞，在確認柱子通氣的情況下，檢查柱子到檢測器的連接管路是否堵塞。尾吹氣沒加上：調節尾吹流量，如果記錄筆不動（在保證火點著和儀器正常情況下），應懷疑流量不夠。關掉氫氣和空氣，噴嘴口若沒有氣流，證明是氣路堵塞或尾吹管路堵塞。靈敏度太低；可能高壓沒加上，絕緣不好等儀器本身的問題，也有操作上的原因，高阻太低，衰減大大，記錄儀滿刻度毫伏數大大等。毛細管色譜常用10 ~10 歐姆的高阻，衰減盡可能小，記錄儀滿刻度1毫伏（噪音可允許的情況下）。如果記錄儀滿刻度只有5毫伏或10毫伏，衰減可相應小一些或高阻高一擋。另外，柱子從中間斷開。樣品濃度大低、放空流量太大。注射針堵塞等原因都可能造成不出峰。
1.7.2色譜峰拖尾，如（圖5）
圖5拖尾峰和前伸峰
拖尾峰引起的原因比較復雜，毛細管柱和儀器系統都可能引起拖尾柱子兩端安裝不正確，沒有超過分流點和尾吹點；或者是安裝好后又在接頭處斷裂；柱外死體積較大；尾吹氣流量小，樣品在柱內或者系統內壁非線性吸附；汽化室污染，此時應檢查柱子的連接是否正確，有無斷裂，尾吹氣流量是否合適，強極性組份在金屬、載體、固定液和載氣以及固定液和玻璃界面上都會發生吸附作用，這些表面吸附作用可以通過表面純化來解決。是將系統全玻璃化，并使用石英毛細管柱，或將樣品適當地轉化。圖5拖尾峰和前峰前伸峰是由于進樣量太大，柱子超負荷，進樣器或柱溫太低引起的、只要提高儀器的靈敏度，減小進樣量，提高進樣器溫度或柱溫，就能或少解決色譜峰的前伸問題。
1．毛細管的安裝
毛細管柱的安裝常為人們所忽視，往往會出現作填充色譜柱多年的技術人員，剛使用毛細管柱時，做出的色譜圖還不如填充柱的色譜圖，這使人們很難理解。但究其原因，多數是由于毛細管柱的安裝和操作上的毛病，而不是柱子本身和儀器系統的問題。因此，一根好的毛細管柱和設計得很好的色譜系統，還必須使柱子在系統中安裝得合理，才能做出好的結果。
1.1毛細管柱與進樣器的連接對于分流進樣，毛細管柱的入口端一定要伸過分流進樣器的分流出口（圖1A），亦就是使毛細管柱的入口處于載氣的高流速區域。如果毛細管柱的入口在分流進樣器的分流出口以下（圖1B），處于載氣的低流速區域，得到的色譜圖還不如填充柱，所以必須將毛細管的入口伸過分流進樣器的分流出口，這樣才會得到尖銳的峰形。對于分流/不分流進樣，毛細管的入口應接到進樣器的底部（圖1c）這樣可以使汽化管中的樣品*進入柱子，也不會出現氣流清洗不到的“死區”。
圖1A、B、C毛細管柱與進樣器的連接示意圖
1.2毛細管柱與檢測器的連接
在毛細管連接到檢測器之前，先接通載氣，看一下柱子的出口是否有載氣通過，（將柱子出口浸入清水中看是否有氣泡出現）如果沒有載氣從柱子出來，說明柱前的系統中有的地方漏氣或柱子堵塞，應找出原因加以解決。然后將柱子的未端盡可能的伸到檢FID）的噴嘴以下的1~2厘米處（但不能超過噴嘴如圖2 ，并使柱子的出口處于氣流的zui高流速區域（即氫氣引入口以上），如果柱子不能直接伸到檢測器的噴嘴下1~2厘米處，但必須伸到尾吹氣入口的上部使柱子的未端處于氣流的高速區域。
圖2 毛細管柱與檢測器的連接示意圖
1.3分流比的測定與選擇
分流比可以定義：樣品*汽化時與載氣充分混合后，樣品通過分流進樣器進入柱子的流量FC與通過分流器的流量F分流之比：分流比= FC/F分流（式1）有的人把分流比定義為：樣品進入汽化室后，進樣器中總的流速=FC十F 分流與柱流速FC之比：分流=FC/FC +F分流（式2）例如，柱子出口流速為1ml/分，分流器放空的流速為99ml／分，則分流比為100:1 ，因為柱流速FC比分流流速小所以（式1）、（式2）的結果很相近，FC和F 分流可通過皂沫流量計測量。如果載氣通過毛細管柱的流量很小，用皂沫流量計不容易測，FC也可以通過計算求出： FC= 60uπr2 其中u為載氣的平均線速度，單位厘米／秒。u可以通過進樣后用某物質的保留時間求得，某物質可以用甲烷、甲醇等均可，要求是色譜柱對該物質的吸附要小，一般以甲烷為宜，具體計算方法為：u=柱長（厘米）/保留）分流比及分流有大小靠分流閥進行調節，選擇適當的分流比也很重要。如果分流比很小，樣品大多數進入柱子、容易使峰變寬，形成前伸峰。分流比一般選擇在1:100~200之間，這時樣品的起始組分的譜帶擴展很小，出峰尖銳。對一根0.25mm內徑的毛細管，用N2作載氣，*流速0.3~0.4ml/分，則分流流量調到50ml/分左右即可。在毛細管分流進樣系統中一般以柱頭壓力來恒量柱流量的大小，下表給出一些常用的毛細管柱在標準線速度的情況下的柱頭壓力：
上表所使用的載氣為氮氣，線速度為20cm/秒。或氫氣，線速度為40cm/秒。
1.4尾吹氣流量的測量與選擇
毛細管色譜分析用FID檢測器時，一定要加尾吹氣，一般用空氣或N2氣。加尾吹氣的作用之一是減少柱后死體積對色譜峰造成的擴散，之二是保證FID有合適的氮氫比。FID系質量型檢測器，適當地增加尾吹氣可提高檢測的靈敏度（圖3），但尾吹氣太高，會引起基線不穩以至滅火，尾吹氣太低，會引起色譜峰拖尾、對毛細管柱效損失大大。尾吹氣流量一般在20-30ml比較適合，可用皂沫流量計來測量。
圖3尾吹氣流速對峰高的影響
1.5 毛細管柱的老化
涂漬好的毛細管柱首先要經過充分的老化，以除去固定液中的低分子量物質，一般商品毛細管柱，在制造出廠前都已經過充分老化；但柱子一經從儀器上拆卸下來，較長時間接觸空氣，在下一次使用之前，以較低的初始溫度程序升溫至zui高使用溫度老化2—3次。各種固定液因其性質和生產廠家不同而zui高使用溫度有所不同，所以要注意毛細管柱的說明，生產毛細管柱的廠家應注明zui高使用溫度。老化中應注意載氣的流速不易過大，否則會破壞均勻的液膜。一般非極性柱在250℃以下老化使用，可用普通氮氣，在250℃以上高溫使用時，必須使用高純氮氣或普通氮氣經脫氧后使用，以延長柱子的使用壽命。對極性柱，尤其是PEG類（聚乙二醇）、FFAP、含氰基的固定液（OV225、•OV275），一定要用高純氮氣（高純氮氣經過脫氧，）99.99%否則，固定液很快被氧化，以致不能使用。
1.6交聯毛細管柱的清洗
交聯毛細管柱zui重要的優點是當柱被可溶性有機重組分污時，可以用溶劑清洗除去污染物，使柱得以再生，根據污染的性質，可適用非極性溶劑（如正戊烷）或極性浴劑（如二氯甲烷、丙酮、苯等）。每個試驗室都可以做一簡單設備，如（圖4）來進行清洗。清洗方法：將溶劑裝入小瓶的2/3處，把毛細管的出口端（接檢測器的一端）刺過青霉素的橡皮蓋插入溶劑底部。（青霉橡皮蓋較硬，不易被彈性石英毛細管刺透，可用一金屬絲或注射針預先刺透，在留的痕跡處插入石英毛細管）。接著用25ml或50ml的注射針，向小瓶內壓入空氣，溶液即會壓入柱內，直全部溶劑從柱中流出，（如果是20米以上的大口徑毛細管柱，再加一次溶劑清洗） 隨后，將柱從小瓶中拉出與儀器的進樣連接，用載氣將柱中的溶劑吹干后，再把柱的另一端與檢測連接。用程序升溫的方式老化l～2次，即可使用。清洗過程應注意：①溶劑必須用分析純試劑；②溶劑在柱浸泡時間不能過長，以防止固定液液膜溶漲，使柱效下降。
1．25或50ml注射器 2．青霉素小瓶 3．毛細管柱
圖4清洗方法示意圖
1.7毛細管色譜分析中常見故障及排除
1.7.1進樣不出峰
這是zui常見的問題之一，主要原因有以下凡個方面：漏氣：進樣隔墊、柱子兩端的接頭以及放空針形閥前的連接處漏氣?；鹧嫦纾赫{節氫氣或尾吹氣流量的大小，看記錄筆是否向一邊偏移，如筆不動，說明火熄了或火沒點著。電路不正常：離子線、放大器、記錄儀連線接錯或接觸不好，放大器有問題。系統堵塞：在上述情況均正常時應懷疑系統堵塞，樣品沒有進到檢測器，先檢查柱后是否有氣流通過，如果沒有氣流通過，可能柱子堵塞，從柱后折斷1~2厘米，仍不通氣，再檢查柱前是否堵塞，在確認柱子通氣的情況下，檢查柱子到檢測器的連接管路是否堵塞。尾吹氣沒加上：調節尾吹流量，如果記錄筆不動（在保證火點著和儀器正常情況下），應懷疑流量不夠。關掉氫氣和空氣，噴嘴口若沒有氣流，證明是氣路堵塞或尾吹管路堵塞。靈敏度太低；可能高壓沒加上，絕緣不好等儀器本身的問題，也有操作上的原因，高阻太低，衰減大大，記錄儀滿刻度毫伏數大大等。毛細管色譜常用10 ~10 歐姆的高阻，衰減盡可能小，記錄儀滿刻度1毫伏（噪音可允許的情況下）。如果記錄儀滿刻度只有5毫伏或10毫伏，衰減可相應小一些或高阻高一擋。另外，柱子從中間斷開。樣品濃度大低、放空流量太大。注射針堵塞等原因都可能造成不出峰。
1.7.2色譜峰拖尾，如（圖5）
圖5拖尾峰和前伸峰
拖尾峰引起的原因比較復雜，毛細管柱和儀器系統都可能引起拖尾柱子兩端安裝不正確，沒有超過分流點和尾吹點；或者是安裝好后又在接頭處斷裂；柱外死體積較大；尾吹氣流量小，樣品在柱內或者系統內壁非線性吸附；汽化室污染，此時應檢查柱子的連接是否正確，有無斷裂，尾吹氣流量是否合適，強極性組份在金屬、載體、固定液和載氣以及固定液和玻璃界面上都會發生吸附作用，這些表面吸附作用可以通過表面純化來解決。是將系統全玻璃化，并使用石英毛細管柱，或將樣品適當地轉化。圖5拖尾峰和前峰前伸峰是由于進樣量太大，柱子超負荷，進樣器或柱溫太低引起的、只要提高儀器的靈敏度，減小進樣量，提高進樣器溫度或柱溫，就能或少解決色譜峰的前伸問題。
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