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第五章 蛋白電泳
閱讀：2480 發布時間：2015-7-14第五章 蛋白電泳
5.1 SDS-PAGE 基本原理
1. SDS-PAGE 是在蛋白質樣品中加入 SDS 和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS 是一種很強的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。
2. 強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構。使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側鏈與 SDS 充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS 復合物。
3. 蛋白質分子結合 SDS 陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質之間所帶凈電荷的差異。蛋白質的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質量，而與其所帶電荷的性質無關。
5.2 PAGE：聚丙烯酰胺凝膠
聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰胺（acrylamide，簡稱Acr）和交聯劑（crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱 Bis）在催化劑（過硫酸胺或核黃素 AP）和加速劑（四甲基乙二胺 TEMED）作用下聚合交聯而成的三維網狀結構的凝膠。化學惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質。聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基（free radicals）的催化，使體系發生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來完成的。催化體系主要有化學催化（AP-TEMED）和光化學催化（核黃素-TMTED）體系。
5.3 聚丙烯酰胺凝膠分類
PAGE 分為連續系統和不連續系統兩大類。連續系統電泳體系中緩沖液 pH 值與凝膠中的相同。帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續系統中帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。
不連續系統的濃縮效應：
凝膠層的不連續性：濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小。在電場的作用下，蛋白質顆粒在大孔膠中遇到的阻力小，移動快。而在小孔膠中遇到的阻力大，移動慢。因此，在兩層凝膠的交界處，由于凝膠孔徑的不連續性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶。緩沖液離子成分和pH的不連續性：HCl易解離出Cl-，它在電場中遷移率大，走在zui前面，故稱為快離子或前導離子。電極緩沖液中的甘氨酸在pH6.8 的緩沖液中解離度很小，僅為 0.1-1%，因而在電場中遷移率很小，稱為慢離子或尾隨離子。蛋白質均帶負電荷，在電場中均移向正極，其有效遷移率介于快慢離 子之間，于是蛋白質就在快慢離子間形成的界面處，被濃縮成極窄的區帶。當進入pH8.8的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質，因此氯離子和甘氨酸離子沿著離子界面繼續前進。蛋白質分子由于分子量大，被留在后面，然后分離成多個區帶。