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一.直接免疫熒光法測抗原
基本原理
將熒光素標記在相應的抗體上,直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少,相對使用標記抗體用量偏大。
試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
熒光標記的抗體溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS進行稀釋
緩沖甘油:分析純無熒光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
搪瓷桶三只(內有0.01mol/L,pH7.4的PBS1500ml)
有蓋搪瓷盒一只(內鋪一層浸濕的紗布墊)
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
實驗步驟
1.滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待檢標本片上,10min后棄去,使標本保持一定濕度。
2.滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,使其*覆蓋標本,置于有蓋搪瓷盒內,保溫一30min定時間(參考:30min)。
3.取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗后,再按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5min,不時振蕩。
4.取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。
5.立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度,一般可用“+”表示:(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++--++++)熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上,而各種對照顯示為(±)或(-),即可判定為陽性。
注意事項
1.對熒光標記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋在1:20-100之間,要自行摸索*梯度,建立的稀釋比例,抗體濃度過低,會導致產生的熒光過弱,影響結果的觀察。
2.染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化,染色時間可以從10min到數小時,一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。
3.為了保證熒光染色的正確性,試驗時需設置下述對照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
(1)標本自發熒光對照:標本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。
(2)特異性對照(抑制試驗):標本加未標記的特異性抗體,再加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,待檢標本呈強熒光,則為特異性陽性染色。
4.一般標本在高壓*燈下照射超過3min,就有熒光減弱現象,經熒光染色的標本在當天觀察,隨著時間的延長,熒光強度會逐漸下降。
二.間接免疫熒光法測抗原
基本原理
染色程序分為兩步,*步,用已知未標記的抗體(待檢標本)加到已知抗原(待檢標本)標本上,在濕盒中37℃保溫30min,使抗原抗體充分結合,然后洗滌,除去未結合的抗體。
第二步,加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體(通常為熒光標記的對應二抗)。如果*步發生了抗原抗體反應,標記的熒光標記的二抗就會和已結合抗原的抗體進一步結合,從而可鑒定被檢測抗原。
試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
緩沖甘油:分析純無熒光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
熒光標記的抗人球蛋白抗體:以0.01mol/L,pH7.4的PBS進行稀釋。
搪瓷桶三只(內有0.01mol/L,pH7.4的PBS1500ml)
有蓋搪瓷盒一只(內鋪一層浸濕的紗布墊)
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
實驗步驟
1.滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于未知抗原標本片,10min后棄去,使標本片保持一定濕度。
2.滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS適當稀釋抗體,覆蓋未知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內,37℃保溫30min。
3.取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗1-2次,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不時振蕩。
4.取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標記二抗
5.將玻片平放在有蓋搪瓷盒內,37℃保溫30min。
6.重復操作3。
7.取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。
8.熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結果判定同直接法。
注意事項
1.熒光染色后一般在1h內完成觀察,或于4℃保存4h,時間過長,會使熒光減弱。
2.每次試驗時,需設置以下兩種對照:
(1)陰性對照:陰性血清+熒光標記物(需有使用人員自行建立標準)
(2)熒光標記物對照:PBS+熒光標記物如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,待檢標本呈強熒光,則為特異性陽性染色。
3.未知抗原標本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。
4.所滴加的抗體或熒光標記物,應始終保持在未知抗原標本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。
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