Brdu細(xì)胞增殖檢測

BrdU作為一種胸腺嘧啶核苷的類似物（其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是胸腺嘧啶的堿基嘧啶環(huán)上與5位C原子連接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一樣可摻入到細(xì)胞合成的DNA中。當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期而同時(shí)又有BrdU存在時(shí), 就會(huì)有BrdU摻入新合成的DNA中，只要細(xì)胞不消亡，這種BrdU就在胞核的DNA中長期存留。摻入到DNA的BrdU可通過抗BrdU單克隆抗體在組織切片或細(xì)胞爬片上顯示。該方法能對細(xì)胞增值進(jìn)行迅速而穩(wěn)定的測量, 而且標(biāo)記BrdU的細(xì)胞只要不受到紫外線照射，對細(xì)胞本身沒有功能損害。
 
操作步驟
1. 細(xì)胞以1.5×105 /ml細(xì)胞數(shù)接種于直徑35ml培養(yǎng)皿中（內(nèi)放置一蓋玻片），培養(yǎng)1天，用含0.4％FCS培養(yǎng)液同步化3天，使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0 期。
2. 終止細(xì)胞培養(yǎng)前，加入BrdU（終濃度為30μg/L），37℃，孵育40min。
3. 棄培養(yǎng)液，玻片用PBS洗滌3次。
4. 甲醇/醋酸固定10min。
5. 經(jīng)固定的玻片空氣干燥，0.3％H2 O2 -甲醇30min滅活內(nèi)源性氧化酶。
6. 5％正常兔血清封閉。
7. 甲酰胺100℃，5min變性核酸。
8. 冰浴冷卻后PBS洗滌，加1抗即抗小鼠BrdU單抗（工作濃度1：50），陰性對照加PBS或血清。
9. 按ABC法進(jìn)行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算標(biāo)記指數(shù)（LI）。
客戶提供
1. 提供新鮮的肝素或者EDTA抗凝的外周血；
2. 提供新鮮的培養(yǎng)細(xì)胞，提供新鮮組織，需要實(shí)驗(yàn)室制備成單細(xì)胞懸液。
 
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