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Solarbio 大鼠脾臟NK細胞分離液試劑盒

一、 脾臟組織單細胞懸液的制備方法
注：A．全過程及所需試劑要求無菌環境。
B．本試劑盒中不包含膠原酶，若采用酶消化法制備單細胞懸液，請用戶根據各實驗室要求另購不同類型膠原酶。
1. 剪碎法：將組織塊放入平皿后，加入少量F液及20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪勻漿狀，加入5mL F液及20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用100目不銹鋼濾網(另購)過濾到試管內；離心沉淀1500轉/分×3 min，再用細胞清洗液清洗3次，每次以500rpm短時低速離心除去細胞碎片，以200目不銹鋼濾網（另購）過濾去細胞團塊。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5）×107個/mL。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用20%胎牛血清或樣本稀釋液懸起細胞濃度為2×108~1×109個/mL的單細胞懸液備用。
2. 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入70mL組織研磨器內，加入2mLF液及20%胎牛血清；緩慢轉動研棒，研磨勻漿；用5mLF液及20%胎牛血清沖洗研器；收集細胞懸液，經200目不銹鋼濾網（另購）過濾；離心沉淀800rpm×2min ，再用細胞清洗液洗3次，離心沉淀。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5）×107個/mL。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用20%胎牛血清或樣本稀釋液懸起細胞濃度為2×108~1×109個/mL的單細胞懸液備用。
3. 酶消化法： 
A．用F液將膠原酶稀釋，終濃度為400 U/mL，于冰浴備用。 
B．取一適當大小培養皿進行操作：用鑷子夾碎動物脾臟，加入稀釋后的膠原酶，37℃消化20分鐘。 
C．以100或200目不銹鋼濾網（另購）過濾，離心沉淀800prm×2min ，再用細胞清洗液洗3次，離心沉淀。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5）×107個/mL。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用20%胎牛血清或樣本稀釋液懸起細胞濃度為2×108~1×109個/mL的單細胞懸液備用。
細胞計數方法: 
細胞計數法是用來計數細胞懸液中細胞數量的一種方法。一般利用計數板（血球計數板）進行。既可用于分離（散）細胞培養接種前計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，也可用于對培養物的細胞數量進行計數。不論計數的對象如何，均須制備分散的細胞懸液。 
計數與計算過程 
1）在細胞計數板中央放置計數的蓋玻片。 
2）用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數板凹蹧處流出懸液，蓋玻片被液體充滿為止。 
3）置顯微鏡下計數四角大方格內的細胞總數。對于壓線的細胞只計數在上線和左線者，對于細胞團按單個細胞計數。 
4）按下式計數細胞懸液的密度： 細胞密度＝（4個大格細胞總數/4）×104個/mL×稀釋倍數
公式中乘以104 因為計數板中每一個大格的體積為：
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3而 1mL＝1000mm3
細胞計數要點： 
A．進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于104個/mL，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中；顯微鏡下計數時，遇到2個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算。如果細胞團>10％，說明細胞分散不充分; 或細胞數<200個/10mm2或>500個/10 mm2 時，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液。 
B．要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。 
C．取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確； 
D．數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。 
E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。
二、脾臟淋巴細胞分離方法
1．取1mL脾臟細胞懸液（細胞濃度為2×108~1×109個/mL）小心疊加在淋巴細胞分離液之上（比例為1：1），20℃±2℃，400g（約1500 轉/分），離心20 分鐘（半徑15cm 水平轉子）。
2.  此時離心管中由上下細胞分四層。層;為稀釋液層。第二層；為環狀乳白色淋巴細胞層。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細胞層。收集第二層細胞放入含細胞清洗液4-5 毫升的試管中，充分混勻后，以500g（約1800 轉/分）離心20 分鐘。沉淀經反復洗滌2 次即得所需淋巴細胞。
注： 提取率約為80%。
三、 注意事項
1. 本分離液是敏光型的，在運輸和貯藏過程中應在18℃-25℃避光保存，啟封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于10℃ 以下易出現白色結晶，影響分離效果。
2. 待分離的組織要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一定在20℃水浴箱中復溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果好，且所有操作過程一定要在無菌條件下進行。
3. 由于各品牌離心機的性能不同，國內南北地區溫度環境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調節離心轉數，調節離心的時間，摸索好的分離條件（具體分離條件各實驗室自定）。
4. 使用無靜電反應的離心管，推薦使用未經過堿處理的玻璃離心管。
四、產品性能指標
pH                             7.0-7.5
滲透壓                         280-340mOsmol/kg
內毒素                         ≤0.5EU/mL
無菌                           直接接種培養14 天后培養基澄清
澄明度及不溶性顆粒物           每50mL 溶液中含10μm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25μm 以上的不溶性微粒5 粒以下

Solarbio 大鼠脾臟NK細胞分離液試劑盒