人類基因組計(jì)劃的成功實(shí)施，我們已初步掌握了自身的遺傳信息。但闡明人類基因組整體功能的功能基因組學(xué)仍任重而道遠(yuǎn)。蛋白質(zhì)作為生命活動的"執(zhí)行者"，自然成為生命科學(xué)研究的新"寵兒"。幾乎在所有生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，科學(xué)研究工作者都需要對細(xì)胞、組織或完整生物體的蛋白進(jìn)行定性描述或定量檢測。對一種細(xì)胞、組織或完整生物體所擁有的全套蛋白質(zhì)為特征的蛋白組學(xué)在生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要作用!
目前，我們對蛋白組學(xué)的了解需要更清楚、完整的信息，比如說確定在細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)種類的數(shù)目，以及所有蛋白組分在不同條件下的表達(dá)水平等等。
盡管在生命科學(xué)領(lǐng)域，定量蛋白質(zhì)組學(xué)開始顯現(xiàn)著越來越重要的作用。但對科學(xué)工作者和醫(yī)學(xué)研究人員來說，技術(shù)上仍存在著巨大的挑戰(zhàn)。這些構(gòu)成蛋白組的各種蛋白會隨著不同組織、不同環(huán)境狀態(tài)而發(fā)生改變。一種蛋白在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一個(gè)基因可以有多種mRNA形式的剪接，并且同一蛋白可能存在多種形式的翻譯后修飾。很多蛋白廣泛地存在各種生物體液中，而且它們的存在形式和濃度都存在著巨大差別。所以說，蛋白質(zhì)組不僅僅是基因組的直接產(chǎn)物。現(xiàn)在生命科學(xué)領(lǐng)域急需新的技術(shù)和研究方法對蛋白組信息有一個(gè)完整理解。
"從現(xiàn)在起，我們希望能夠?qū)我粚?shí)驗(yàn)中進(jìn)行所有蛋白進(jìn)行全面測定。這跟當(dāng)下我們所用的RNA-Seq技術(shù)差不多一樣。"RobertL.Moritz教授說道。他的實(shí)驗(yàn)室一直致力于開發(fā)新的技術(shù)和數(shù)據(jù)分析工具來定量檢測蛋白質(zhì)，尤其是在疾病狀態(tài)下，分析這些蛋白所發(fā)揮的作用。
在質(zhì)譜檢測中存在著一個(gè)技術(shù)難題，雖然質(zhì)譜能檢測蛋白組里所有蛋白(肽段)，但一些被預(yù)期出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上的多肽或蛋白，在質(zhì)譜中仍不能被檢測。"根據(jù)質(zhì)譜分析的序列，我們不一定能看到蛋白質(zhì)的整個(gè)氨基酸序列。但是，有時(shí)候我們能一直看到這個(gè)蛋白的某段序列。"RobertL.Moritz教授提到。所以需要建立一個(gè)分析方法來確定，對一個(gè)多肽的檢測為陰性是來自于實(shí)驗(yàn)儀器不能檢測到，還是來自于其他原因，比如說就是實(shí)驗(yàn)處理后出現(xiàn)預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。RobertL.Moritz教授解釋道："之所以我們對某一個(gè)特定蛋白質(zhì)的任何肽段都檢測不到，原因可能是這個(gè)蛋白只在特定條件下，在特定的組織或細(xì)胞被表達(dá)。"
許多肽段能在質(zhì)譜中被檢測，而這些信息被統(tǒng)計(jì)在一個(gè)數(shù)據(jù)庫，叫PeptideAtlas。2005年，PeptideAtlas數(shù)據(jù)庫成立，從開始到現(xiàn)在，來自多種不同物種的質(zhì)譜數(shù)據(jù)仍在大幅增加和更新。它既是一個(gè)龐大的數(shù)據(jù)庫，同時(shí)也對蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供了重要的查詢資源。
PeptideAtlas數(shù)據(jù)庫允許科研工作者查到每個(gè)多肽的檢索記錄，以及每個(gè)多肽的所有特性。另外，PeptideAtlas同樣能給科研工作者在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)提供資源和指導(dǎo)。
近來，Moritz博士的研究小組，開發(fā)了新一代數(shù)據(jù)庫，叫AltasProphet。它是一個(gè)更高精度，覆蓋率更廣，而且是在蛋白質(zhì)組學(xué)的背景下，升級的質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理平臺。他們認(rèn)為，質(zhì)譜技術(shù)仍有許多需要改進(jìn)的方面，比如說速度和靈敏度這兩個(gè)方面。現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了可供檢測并定量一些蛋白(包括一些蛋白的亞型)的新興技術(shù)，。
下面總結(jié)一下目前這些新興技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究運(yùn)用，以下面四個(gè)例子來說明。
1)對神經(jīng)退行性疾病(如阿茲海默癥)進(jìn)行蛋白組學(xué)相關(guān)標(biāo)志物跟蹤的研究
"我們已經(jīng)找到三種可以降低阿茲海默癥疾病風(fēng)險(xiǎn)的干預(yù)手段，全部都來自于蛋白組學(xué)的研究結(jié)果。"來自肯塔基大學(xué)生物化學(xué)教授AllanButterfield說道。他跟加州大學(xué)歐文分校的研究人員合作在人類衰老動物模型研究中，用三種不同方式來干預(yù)動物衰老(評估動物在認(rèn)知上出現(xiàn)損傷的風(fēng)險(xiǎn))，包括改變飲食、改變身體活動和智力刺激。
動物模型是比格犬，它擁有跟人類一樣β-肽序列，并具有學(xué)習(xí)復(fù)雜認(rèn)知任務(wù)的能力。這些證明比格犬可以用于研究人類中阿茲海默癥發(fā)生原因的實(shí)驗(yàn)動物模型。
科研工作者將12歲的比格犬分三組，*組喂富集抗氧化的食物;第二組進(jìn)行體能鍛煉干預(yù);zui后一組進(jìn)行智力訓(xùn)練組，這些干預(yù)在比格犬上持續(xù)了三年。通過zui后比格犬的認(rèn)知測試結(jié)果，這些經(jīng)歷過三種不同干預(yù)措施后15歲(12歲 3歲)比格犬跟4歲的比格犬的認(rèn)知能力相似。并發(fā)現(xiàn)比格犬在認(rèn)知上的改善伴隨著大腦中β淀粉樣蛋白塊水平下降。并且，這些干預(yù)后的比格犬大腦氧化應(yīng)激水平與4歲的比格犬幾乎一致。而對照組(正常飲食的比格犬)的大腦出現(xiàn)了跟阿茲海默氏癥一致病理癥狀。通過蛋白質(zhì)組學(xué)檢測出大腦組織中氧化蛋白水平明顯增加。在這項(xiàng)飲食和生活方式干預(yù)改變認(rèn)知的研究中，科學(xué)工作者使用蛋白組學(xué)找到了與神經(jīng)退化性疾病相關(guān)的蛋白，也探索了這些蛋白之間的相互作用和信號調(diào)控通路，并證實(shí)了之前類似研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在研究神經(jīng)變性疾病領(lǐng)域中，很難在病癥早期發(fā)現(xiàn)病理學(xué)等變化。如果在臨床疾病的發(fā)病前做一些相應(yīng)的干預(yù)，可能降低疾病的發(fā)生和減緩進(jìn)展、并提高生活質(zhì)量和延長壽命。
目前蛋白質(zhì)組學(xué)面臨的挑戰(zhàn)是數(shù)據(jù)難以輸出。但是，如果生物信息學(xué)和質(zhì)譜等蛋白質(zhì)分技術(shù)進(jìn)步相一致時(shí)，這將標(biāo)志著蛋白質(zhì)組學(xué)的真正成熟。
2)在腫瘤研究中分析過表達(dá)的蛋白組來控制癌癥
來自密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院的DavidM.Luban教授說："蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域內(nèi)存在一個(gè)重大的難題，很難做到在同時(shí)測到大量樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。現(xiàn)在已經(jīng)有很多團(tuán)隊(duì)在在這個(gè)難題上攻堅(jiān)克難，但目前這些新興的工具還遠(yuǎn)沒成熟到可供我們使用。"
Luban博士和他的同事在zui近的一項(xiàng)研究中，利用腫瘤干細(xì)胞上的生物標(biāo)記物，分離出來兩種乳腺癌腫瘤干細(xì)胞亞型：ALDH、CD44雙陽性和ALDH、CD24雙陽性干細(xì)胞群。在癌癥研究中，對于腫瘤干細(xì)胞的特性了解非常重要，這方面的研究可以找到腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理，以及對攻克癌癥耐藥難題有很大的幫助。
科學(xué)工作者首先使用蛋白質(zhì)組學(xué)來分析比較這兩種不同亞型的乳腺癌干細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況。通過這一步他們鑒定出了3304種蛋白在兩種細(xì)胞亞型中存在差異。接下來，他們使用無標(biāo)記蛋白定量手段，還找到并研究了這兩種不同干細(xì)胞表型的分子調(diào)控機(jī)理。Luban博士說："在這項(xiàng)研究中，我們已經(jīng)通過代謝組學(xué)確定了幾個(gè)關(guān)鍵蛋白，現(xiàn)在已經(jīng)開始下一步的研究。"
無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組分析技術(shù)可以檢測一種蛋白相匹配的的所有肽段，并可以確定它在總蛋白中所占的具體比例。在蛋白組學(xué)中常用的標(biāo)記蛋白分析技術(shù)，如果細(xì)胞數(shù)非常少的條件下，對樣品分析存在很大的挑戰(zhàn)，而這一技術(shù)正好可以解決這一難題。現(xiàn)在他們希望能通過這個(gè)辦法對腫瘤干細(xì)胞(少于10,000個(gè)細(xì)胞)的樣品中蛋白進(jìn)行更為細(xì)致蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
3)通過蛋白組學(xué)解析生物行為學(xué)的問題
來自哥倫比亞大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)LeonardFoster博士分析比較了蜜蜂體內(nèi)的1,200種蛋白，試圖從蜜蜂體內(nèi)蛋白表達(dá)組信息與蜜蜂行為學(xué)上建立一種。
"在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域仍普遍存在著一個(gè)難題：蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)往往費(fèi)時(shí)耗力，而且一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)很難重復(fù)。這個(gè)難題需要通過蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展和改進(jìn)來解決。現(xiàn)有的一些實(shí)驗(yàn)方法所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能很好地解釋生物行為學(xué)上的問題，也就是說很多實(shí)驗(yàn)結(jié)論不能有效地支持這些生物的行為學(xué)等現(xiàn)象。"LeonardFoster博士說道。
LeonardFoster博士和他的研究小組對蜜蜂與其體外寄生螨蟲之間的相互作用感興趣。蜜蜂存在兩個(gè)可遺傳的抵御體外寄生螨蟲的生物機(jī)制：一個(gè)是集體行為模式;另一個(gè)是對螨蟲的敏感程度的機(jī)制。而這兩個(gè)機(jī)制在不同蜜蜂之間所起的調(diào)控作用也存在差異，而目前這兩個(gè)遺傳學(xué)和生物信號傳導(dǎo)的機(jī)理都不清楚。
LeonardFoster博士和他的同事測量了蜜蜂觸角和幼蟲體內(nèi)大約1,200種蛋白質(zhì)的相對豐度，還描述了這些蛋白在蜜蜂免疫力，以及蜜蜂跟寄生蟲之間所起的調(diào)控作用。這一次研究證明了蛋白表達(dá)譜與蜜蜂行為模式之間存在著相關(guān)性。
另外，zui近他們另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)半乳糖誘導(dǎo)了PKA1基因(表達(dá)PKA蛋白的催化亞基)表達(dá)，而葡萄糖會抑制該基因的表達(dá)。通過這個(gè)系統(tǒng)，研究工作者鑒定了在真菌病原體、新型隱球菌等其他類似疾病的真菌的分泌蛋白吧被哪些蛋白調(diào)控。
"這種定量檢測蛋白方法非常，半定量方法不能對培養(yǎng)基上清中的分泌蛋白進(jìn)行測定。"LeonardFoster博士研究小組通過這個(gè)定量檢測的方法鑒定了與真菌的生存，和對宿主毒性以及對鐵離子攝取相關(guān)的61種分泌蛋白，其中5個(gè)的表達(dá)分泌與PKA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控相關(guān)。
4)蛋白翻譯后修飾的挑戰(zhàn)
蛋白翻譯后修飾作為蛋白質(zhì)的一個(gè)特性，但這一特性給質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)在定量和評估被修飾后的多肽埋下了巨大的難題。
"在對染色質(zhì)生物研究領(lǐng)域內(nèi)開發(fā)出一類高質(zhì)量抗體來識別蛋白翻譯后修飾是現(xiàn)在急需解決的問題!"來自俄亥俄州立大學(xué)的MichaelA.Freitas博士說，"但目前為止，所能使用的這種高品質(zhì)抗體仍為數(shù)甚少。"
然而，即使有這樣的抗體可用，但它們所識別具體表位會被臨近肽段翻譯后修飾而發(fā)生改變，從而變得毫無用處，或達(dá)不到檢測的標(biāo)準(zhǔn)，組蛋白H3K9S10就是一個(gè)典型的例子。在Freitas博士的實(shí)驗(yàn)室，他們經(jīng)常會使用用同位素標(biāo)記的氨基酸(stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture,SILAC)來做蛋白組學(xué)的質(zhì)譜分析。他們發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組和處理組中用這種帶同位素標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間，然后進(jìn)行蛋白組學(xué)分析有很多優(yōu)勢。這個(gè)方法可以進(jìn)行相對定量，從而通過質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)分析確定單個(gè)蛋白的翻譯后修飾的程度。但是這個(gè)方法也存在著缺點(diǎn)，比如說在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，被限制只能使用1到2種標(biāo)簽，另外這個(gè)方法不太適合一些不能培養(yǎng)的樣品，以及"路徑"太復(fù)雜的蛋白的質(zhì)譜分析。這個(gè)方法也不適合現(xiàn)行的一種"自上而下"的蛋白組學(xué)分析方法。如果蛋白被蛋白酶消化產(chǎn)生的多肽片段，通過檢測肽段的N末端不能確定在這個(gè)區(qū)域內(nèi)發(fā)生翻譯后修飾，是否與其它區(qū)域(多肽片段)的修飾有關(guān)。這個(gè)難題也將是蛋白組學(xué)研究翻譯后修飾中所面臨的巨大限制。
Freitas博士和他的同事和其他科研工作者合作，實(shí)現(xiàn)了這種"自上而下"的蛋白組質(zhì)譜分析。首先將一個(gè)完整的蛋白質(zhì)置于質(zhì)譜儀中，然后通過高能量的力物理破壞這個(gè)蛋白質(zhì)變成零散的多肽片段。zui后通過對這些多肽片段的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重新"組裝"出這個(gè)蛋白。這樣就保留了這個(gè)蛋白上所有的翻譯后修飾信息。通過這個(gè)方法，F(xiàn)reitas博士和他的同事研究了乳腺癌細(xì)胞中幾種不同組蛋白亞型在細(xì)胞中的功能，以及在細(xì)胞周期中蛋白組的動態(tài)變化，并將一些清楚的翻譯后修飾作為惡性增殖的潛在生物標(biāo)志。
未來十年的科學(xué)研究將越來越顯示出定量蛋白組學(xué)對生命科學(xué)的重大意義!
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