等度洗脫是指實(shí)驗(yàn)過(guò)程中(做樣過(guò)程)從頭到尾只用一種流動(dòng)相。也就是只用一個(gè)泵，輸送同一種流動(dòng)相。
梯度洗脫是指在同一個(gè)分析周期中隨著時(shí)間的變化按一定程序梯度性地改變洗脫液的比例(濃度配比、成 分、離子強(qiáng)度、溶液極性等)或pH，以期將層析柱上不同的組分洗脫出來(lái)的方法。從而可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)(極性)差異較大的組分能按各自適宜的容量因 子k達(dá)到良好的分離目的。梯度洗脫一般分為二元高壓梯度，二元低壓梯度和四元低壓梯度；二元高壓梯度需要兩臺(tái)高壓泵，二元低壓梯度和四元低壓梯度都是只需 要一臺(tái)高壓泵和一個(gè)比列閥。
配置特點(diǎn)：
1. 等度洗脫只需要配置一臺(tái)高壓泵，配置相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低；
2. 二元高壓梯度洗脫需要配置兩臺(tái)高壓泵，一個(gè)混合器及連接管理，配置較高，成本高；
3. 二元低壓梯度洗脫需要配置一臺(tái)高壓泵、一個(gè)二元比例閥、一臺(tái)在線脫氣機(jī)、一個(gè)混合器(脫氣機(jī)和混合器視情況而定，可不選)及連接管路，配置較低，成本較低；
4. 四元低壓梯度洗脫需要配置一臺(tái)高壓泵、一個(gè)四元比例閥、一臺(tái)在線脫氣機(jī)、一個(gè)混合器(視情況而定，可不選)及連接管路，配置較高，成本較低。
梯度洗脫配置相對(duì)復(fù)雜，現(xiàn)主要介紹下梯度洗脫的原理及洗脫要求：
梯度洗脫的原理
具體地講，當(dāng)樣品隨梯度起點(diǎn)的流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱入口時(shí)，由于起點(diǎn)流動(dòng)相中弱洗脫溶劑A含量較高，強(qiáng)洗脫溶劑B含量較低，化合物C1(保留性適中)和化合物C2(保留較強(qiáng))因分配系數(shù)(k值)較高而滯留于色譜柱入口附近，幾乎未移動(dòng)。一段時(shí)間后，B增加到一定數(shù)值，C1的k值達(dá)到足夠小(比如小于10)，其在柱中的移動(dòng)速率明顯增大，并且隨著B的增加，其移動(dòng)速率愈加快速，直到tC1時(shí)流出色譜柱，被檢測(cè)器檢測(cè)到并被記錄成色譜峰C1，tC1雖然比等度時(shí)的保留時(shí)間長(zhǎng)很多，但C1的的平均k值卻很小，因而色譜峰并未展寬，靈敏度仍處于較高水平。B持續(xù)增加，在隨后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)，C2的k值也降到10以下，C2的移動(dòng)速率也開始變快，以與C1類似的方式于tC2被洗脫出色譜柱，其平均k值同樣很小，色譜峰亦未展寬，靈敏度處于較高水平。
流動(dòng)相的梯度變化即流動(dòng)相極性、PH值等的梯度變化，即洗脫能力成梯度變化。
洗脫要求
① 洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使各峰*或基本分離；
② 梯度的上限(強(qiáng)洗脫溶劑的比例)要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來(lái)。
③ 梯度不要上升太快，要恰好使移動(dòng)的區(qū)帶在快到柱末端時(shí)達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過(guò)早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過(guò)晚解吸會(huì)使峰形過(guò)寬。
優(yōu)缺點(diǎn)：
1.等度洗脫優(yōu)點(diǎn)：流速不發(fā)生變化，壓力穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠；
缺點(diǎn)：多組分檢測(cè)或有雜質(zhì)干擾情況下分離度可能會(huì)差，而且不容易優(yōu)化，對(duì)于某些復(fù)雜樣品分析時(shí)間長(zhǎng)，峰形差。
2.二元高壓梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)：每臺(tái)泵的流速都由程序控制，a.多組分檢測(cè)或有雜質(zhì)干擾情況下提高分離能力，b.縮短某些復(fù)雜樣品的分析時(shí)間，c.改善峰形，減少拖尾，d.提高柱效，增加檢測(cè)靈敏度；
缺點(diǎn)：a.流 速變化得由程序控制，有時(shí)會(huì)出錯(cuò),b.壓力可能會(huì)不穩(wěn)定，c.混合時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生氣泡，影響基線噪聲及漂移，d.高壓混合時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生熱量，e.對(duì)混合器要 求很高，如果混合不好，基線噪聲和漂移會(huì)很大，f.由于流動(dòng)相比例發(fā)生變化，基線可能會(huì)漂移，g.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性沒(méi)有等度高，h.故障率高于等度。
3.二元低壓梯度優(yōu)點(diǎn)：只需一臺(tái)泵一個(gè)比例閥，就能達(dá)到梯度洗脫效果；
缺點(diǎn)：低壓混合可能會(huì)產(chǎn)生氣泡，梯度穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度不高。
4.四元低壓梯度優(yōu)點(diǎn)：只需一臺(tái)泵和一個(gè)比列閥，就能達(dá)到梯度洗脫效果，并且同時(shí)可以控制四種流動(dòng)相；
缺點(diǎn)：低壓混合可能會(huì)產(chǎn)生氣泡，需要加在線脫氣機(jī)，梯度穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度不高，對(duì)比列閥要求很高，梯度滯后體積大。
檢測(cè)要求：不同物質(zhì)(所測(cè)物質(zhì))分離度一定要好，峰形要好，分析時(shí)間要短，穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度盡量高，實(shí)驗(yàn)成本盡量低等等。
配置建議：
1.采樣液相色譜法實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)儀器的配置一般盡量簡(jiǎn)單。儀器配置復(fù)雜后，操作就會(huì)復(fù)雜，穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度可能會(huì)受影響，故障率就會(huì)高，使用成本也會(huì)高。在能達(dá)到較好的分離度及峰形的情況下能用等度就用等度；
2.同時(shí)檢測(cè)多種復(fù)雜成分，或是有干擾物的情況下，為達(dá)到滿意的峰形、分離度、分析時(shí)間，就得使用梯度洗脫方式了。各種成分可以使用不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，如農(nóng)殘檢測(cè)、氨基酸檢測(cè)等。要求高的話采用高壓梯度洗脫，要求低的話采用低壓梯度洗脫。
3.流動(dòng)相種類相對(duì)簡(jiǎn)單的話采用二元低壓梯度洗脫，相對(duì)復(fù)雜的話(如洗脫時(shí)需要四種不同溶液的流動(dòng)相)采用四元低壓梯度洗脫
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