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內(nèi)毒素污染對基因治療和細胞治療的影響
閱讀：299 發(fā)布時間：2022-9-27
基因療法正在*改變我們治療人類疾病的方式。任何通過修改個人基因來治療或治愈疾病的技術都被認為是基因療法的形式之一。這些技術可以通過幾種潛在的機理實現(xiàn)。一個基因的致病之處可能被滅活，或被健康的版本所取代，又或者是引進一個新的基因來對抗一種疾病?；蛑委?/span>產(chǎn)品是通過將遺傳物質引入細胞核而發(fā)揮作用的。為了引入遺傳物質，科學家需要一個可將基因、核酸酶或短發(fā)夾RNA（shRNA）運送到人體細胞核的運輸系統(tǒng)。攜帶這種遺傳物質的運輸工具被稱為載體1。
應用于基因治療的載體多種多樣，可分為病毒型和非病毒型。病毒載體是目前美國食品和藥物管理局（FDA）批準的基因療法中使用的載體，而非病毒技術作為一種安全有效地將遺傳物質運送給細胞以達到治療效果的方法正在研究當中1。但與非病毒載體相比，病毒載體的基因轉移效率高10倍至1000倍。然而我們應該意識到，基于非病毒載體的基因療法安全水平高且生產(chǎn)成本低，具有非常高的吸引力，在未來的藥物開發(fā)中具有很大的潛力5。
目前最常見的兩種載體是質粒和病毒。質粒是細胞內(nèi)的一種小型染色體外DNA分子，與染色體DNA物理分離，可以獨立復制。最常以小型環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式出現(xiàn)在細菌中，但有時也會出現(xiàn)在古細菌和真核生物中。在自然界中發(fā)現(xiàn)的質粒，往往攜帶著有利于生物體生存的基因，并能提供獨.特的優(yōu)勢，例如對抗生素的強烈抗性。染色體很大，并且含有在“正常條件“下生活的全部基本遺傳信息，而質粒通常很小，只含有在某些壓力、逆境或疾病狀態(tài)下才可能發(fā)揮作用的額外基因2。另一方面，由病毒載體包裝的基因可以整合到宿主細胞的基因組中并永.久表達。一些類型的病毒可將其基因組插入宿主的細胞質中，但實際上并沒有進入細胞，而另一些病毒會偽.裝成可穿透細胞膜的蛋白分子，進而很容易地進入細胞?？赡馨l(fā)生的病毒性感染主要有兩種類型，一種被稱為裂解性感染，另一種為溶源性感染。裂解循環(huán)的病毒在插入其DNA后不久就迅速產(chǎn)生更多的病毒，隨后從細胞中迸發(fā)出來，繼續(xù)感染越來越多的細胞。溶源性病毒則是將其DNA整合至宿主細胞的DNA后，在對某個觸發(fā)因素作出反應前可在體內(nèi)存活多年。病毒會像細胞一樣繁殖，并且不會對所依賴的宿主造成任何傷害，直至被某種方式觸發(fā)。一旦被觸發(fā)，病毒就會從宿主的DNA中釋放出來，以此創(chuàng)造新的病毒3。
最早應用于基因治療的病毒載體是以腺病毒為基礎的，腺病毒會引起普通感冒以及人類呼吸道、腸道和眼部感染1。腺病毒以雙鏈DNA的形式攜帶遺傳物質。當進入宿主細胞時，這種遺傳物質可短暫存在于細胞核中，因此能夠像其他基因一樣自由進行轉錄。并且，人們發(fā)現(xiàn)腺病毒會在患者體內(nèi)引發(fā)強烈的、具有潛在危險的免疫反應，因此，使用該類型病毒進行基因治療的研究仍在繼續(xù)3。逆轉錄病毒、單純皰疹病毒等其他病毒載體也已被使用。
基因治療產(chǎn)品與所有人體治療藥物一樣，關鍵在于不受內(nèi)毒素污染。內(nèi)毒素，也被稱為脂多糖（lipopolysaccharide）或LPS，是革蘭氏陰性細菌外細胞膜的一種成分。作為一種強力的熱原，微量接觸也會導致危險的發(fā)燒甚至敗血癥。此外，內(nèi)毒素具有高度的耐熱性，很難通過傳統(tǒng)的方法來清除。
根據(jù)FDA管理指南，所有靜脈注射藥品的內(nèi)毒素含量必須低于5 EU每公斤體重。但內(nèi)毒素普遍存在于環(huán)境，實驗室也不例外，因此，基因治療產(chǎn)品在用于人體測試前進行內(nèi)毒素污染測試是至關重要的。
2019年發(fā)表于《Molecular Therapy – Methods & Clinical Development 》的一篇論文測試了一種從重組腺相關病毒（rAAV，一種常見的基因治療載體）原液中去除內(nèi)毒素污染的新方法。大腸桿菌通常是內(nèi)毒素污染的來源，rAAV便是由大腸桿菌中分離出來的質粒DNA制備而來。8
該作者使用LAL（美洲鱟試劑）檢測法來定量內(nèi)毒素水平。清除rAAV原液的挑戰(zhàn)之一是任何殘留的洗滌劑都會引起毒性，還會干擾LAL檢測試劑，從而導致假陰性。其原因在于掩蔽效應，即脂多糖分子被洗滌劑分子包圍，無法與LAL試劑相互作用。因此，作者將洗凈原液中的洗滌劑水平保持在臨界值以下，以便于使用LAL精準地檢測內(nèi)毒素。8
這項研究強調(diào)了*凈化基因治療產(chǎn)品的重要性，以及為了去除殘留的洗滌劑而進行嚴格的交換緩沖液沖洗的必要性。隨著基因治療的普及，科學家們?nèi)皂氁庾R到內(nèi)毒素污染潛在危險的重要性，以及需要避免由于洗滌劑殘留而造成假陰性結果。8
與基于基因療法的治療方法一樣，細胞治療產(chǎn)品也需要考慮可能受到污染的問題。細胞治療產(chǎn)品包括細胞免疫療法、癌癥疫苗和應用于某些治療適應癥的其他類型自體或異體細胞，如造血干細胞和成人及胚胎干細胞?；蛑委熓峭ㄟ^蛋白載體或載體將遺傳物質轉移到合適的細胞中，而細胞治療是將具有相關和必要功能的細胞轉移到患者體內(nèi)。4,6
在實驗室環(huán)境中培養(yǎng)任何一種類型的細胞時，所面臨的首要問題始終是避免污染。生物污染往往是工作的重點，同時也是最容易檢測和避免的。
例如，大多數(shù)細菌或真菌污染在細胞培養(yǎng)基中肉眼可見，并可以使用抗生素處理來預防。而支原體或其他細胞系等其他生物污染物則更難檢出，但仍可通過市面上的檢測試劑盒進行檢測。
化學污染與生物污染相比，受到的關注相對較少，并且更難檢測和避免。其中，最隱蔽的化學污染物就是內(nèi)毒素。潛在的內(nèi)毒素污染源包括水、細胞培養(yǎng)基、血清、玻璃制品和塑料制品。正如本文在基因治療產(chǎn)品部分中所提及，細胞治療中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)毒素對高壓滅菌和輻照都有很強的耐受力，這意味著它們可以在沒有活細菌的情況下存在。其高疏水性也使其對塑料制品具有很強的親和力，而且內(nèi)毒素與活細菌不同，在細胞培養(yǎng)基無法通過肉眼確認。此外，內(nèi)毒素不能用抗生素去除，需要使用專門的內(nèi)毒素清除溶液。
采取措施避免內(nèi)毒素引起的細胞培養(yǎng)問題，可以使研究人員對實驗結果更有信心。為了幫助保持細胞培養(yǎng)物及其產(chǎn)生的療法不受內(nèi)毒素的污染，人們已提出了多種解決方法。其中，包括使用高純度的水和低內(nèi)毒素的FBS，以及使用經(jīng)認證為無內(nèi)毒素的塑料器皿。7 然而，除了使用純化的原材料和試劑外，建立強大的無菌技術和滅菌程序，對減少內(nèi)毒素污染的幾率而言也非常重要。
無菌技術是每一位生物研究人員必須掌握的核心技能之一。為避免出現(xiàn)實驗偽像和潛在的細胞死亡，有必要防止細胞培養(yǎng)物的污染。此外，動物研究中的污染也可能導致感染或死亡。
大多數(shù)生物污染物可以使用漂白劑或乙醇等標準的消毒試劑來避免，但內(nèi)毒素高度穩(wěn)定，在沒有活菌的情況下也能繼續(xù)存在。因此，對于質控技術人員來說，保持嚴格的無菌技術標準操作程序至關重要。
定期更換手套是內(nèi)毒素相關無菌技術的示例之一。沒有經(jīng)驗的細胞培養(yǎng)技術員可能認為經(jīng)常用乙醇噴灑手套就足以保持無菌狀態(tài)，但乙醇可能會帶來內(nèi)毒素污染，因此，應為使用者制定更換手套的頻率標準。
內(nèi)毒素污染會極大地影響體外實驗，特別是涉及免疫細胞的實驗。巨噬細胞對內(nèi)毒素的反應表現(xiàn)為IL-6分泌增加，而T細胞的表現(xiàn)為增殖和淋巴因子的產(chǎn)生增加。
受到內(nèi)毒素的影響，非免疫細胞也可能會失調(diào)。傳統(tǒng)上認為內(nèi)毒素是通過CD14受體起作用的，但缺乏這種受體的細胞仍可對內(nèi)毒素污染表現(xiàn)出強烈的反應。例如，一項研究報告指出，心肌細胞在暴露于內(nèi)毒素時，會出現(xiàn)收縮功能障礙。其他研究也報告了CHO細胞內(nèi)蛋白產(chǎn)生的改變以及輸尿管上皮細胞中克隆效率的改變。
此外，不同的細胞系對內(nèi)毒素污染的靈敏程度差異巨大。一些細胞系在內(nèi)毒素低于1 ng/mL的情況下即表現(xiàn)失調(diào)，而其他細胞系則需要高達5000 ng/mL的濃度。也有理論認為，在培養(yǎng)中生長多年的細胞系（如HeLa和CHO細胞）可能隨著時間的推移被自然選擇為耐內(nèi)毒素?；谶@一點，很難確定一個廣泛適用的內(nèi)毒素污染安全閾值。
進行細胞培養(yǎng)時，購買低含量內(nèi)毒素產(chǎn)品是至關重要的。然而，內(nèi)毒素污染可能在打開試劑后產(chǎn)生，或在玻璃器皿/塑料器皿中轉移污染，因此定期進行內(nèi)毒素檢測顯得十分重要。
對于基因治療和細胞治療產(chǎn)品來說，鱟試劑（LAL）檢測法為量化內(nèi)毒素水平提供了一個兼具成本效益和高靈敏度的選擇。本檢測法依賴于從鱟血液中提取的蛋白，這些蛋白在內(nèi)毒素存在的情況下發(fā)生凝結反應，可以對其定量以獲取高度準確的內(nèi)毒素水平讀數(shù)。在維護我們的基因和細胞治療的安全性方面，特別是應用于大規(guī)模生產(chǎn)以及重要的體外實驗時，這種檢測方法將會繼續(xù)發(fā)揮關鍵作用。
◆相關產(chǎn)品
點擊此處查看相關產(chǎn)品：內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)Toxinometer® ET-7000
點擊此處查看相關產(chǎn)品：PYROSTAR™ ES-F 系列鱟試劑
◆參考文獻
1. | ‘How Does Gene Therapy Work?’ (2020 June). Genehome. Available at URL: https://www. thegenehome.com/how-does-gene-therapywork/vectors?gclid=Cj?KCQjwkZiFBhD9ARIsA GxFX8C53pUEumd-W82HmYSL_5gBGNPtMMD rR_882PILGN_0n9vF8icjPboaAjA-EALw_wcB
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2. | ‘Plasmid’. (2021 May 6). Wikipedia. Available at https://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid
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3. | ‘Vectors in Gene Therapy’. (2020 December 16). Wikipedia. Available at URL: https:// en.wikipedia.org/wiki/Vectors_in_gene_ therapy |
4. | ‘Cellular and Gene Therapy Products’. (2021 March 2). U.S. Food and Drug Administration. Available at URL:https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-genetherapy-products#:~:text=Cellular%20therapy%20products%20include%20cellular,adult%20and%20embryonic%20 stem%20cells |
5. | Lundstrom, K. (2019). “Gene Therapy Today and Tomorrow". National Center for Biotechnology Information, ‘Diseases’. Published online 2019 April 28. Available at URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC6631424/ |
6. | David, A., Professor. “How Cell Therapy differs from Gene Therapy". Future Learn. Available at URL: https://www.futurelearn. com/info/courses/making-babies/0/ steps/23934#:~:text=Whereas%20gene%20 therapy%20involves%20the,appropriate%20 cells%20of%20the%20body.
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7. | Easthope, E. (2020). “Five Easy Ways to Keep Your Cell Cultures Endotoxin-Free". Biocompare, published online 2020 April 20. Available at URL: https://www.biocompare. com/Bench-Tips/563017-Five-Easy-Ways-toKeep-Your-Cell-Cultures-Endotoxin-Free/ |
8. | ‘Removal of Endotoxin from rAAV Samples Using a Simple Detergent-Based Protocol’. (2019 December 13). Molecular TherapyMethods & Clinical Development, published online 2019 September 6. Available at URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC6804492/ |
Lisa Komski
Lisa Komski是FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation LAL部門的銷售總經(jīng)理。在化學和生命科學行業(yè)擁有近30年的職業(yè)生涯，是美國食品和藥物管理局（FDA）要求和cGMP方面的業(yè)務發(fā)展專業(yè)人士。Lisa擁有生物學和醫(yī)學技術學位。
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