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豬瘟檢測卡|非洲豬瘟檢測試劑盒廠家
【北京康森非洲豬瘟快速檢測試劑盒主要成分與含量】
| 組成 | 組 份 | 規 格 |
| A盒 | Buffer A | 25 mL/瓶x1瓶 |
| Buffer B | 60 mL/瓶x1瓶 | |
| BufferC | 1250 μL/管x2管 | |
| DNase-Free吸附柱和收集管 | 50套 | |
| B盒 | 熒光PCR反應液 | 1000 μL/管x1管 |
| Taq酶 | 30 μL/管x1管 | |
| 陰性對照 | 1000 μL/管x1管 | |
| 陽性對照 | 1000 μL/管x1管 | |
| 說明書 | 1份/盒 |
【北京康森非洲豬瘟快速檢測試劑盒用法與判定】
1.樣品處理
血液樣品直接用；
淋巴結、脾臟、扁桃體樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品2.0 g于研缽中充分研磨，再加10.0 mL PBS（pH 7.2，含1萬單位青霉素和1萬單位鏈霉素）混勻（樣品不足2.0 g按1:5比例加PBS），對處理的待檢樣品置70℃，30 min滅活后，3 000 r/min，4 ℃離心5 min，取上清液，編號備用；血球粉處理同上，只不過省掉研磨步驟。
2.樣品存放
采集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應不超過24 h；若需長期保存，須放置-80 ℃冰箱，但應避免反復凍融（凍融不超過3次）。
3.操作步驟
3.1 病毒DNA的提取（使用A盒）
（1）待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數總和用n表示，取n個滅菌的1.5 mL離心管，逐管編號。
（2）每管加入Buffer A 500 L。
（3）每管分別加入已處理的待檢樣品、陽性對照、陰性對照各200 L，充分混勻，室溫放置10分鐘。
（4）取與上述離心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，編號。將離心管中的溶液轉移至DNase-Free吸附柱，（為避免堵塞吸附柱，盡量不要吸懸浮雜質）。
（5）13000 r/min室溫離心30 sec。
（6）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。
（7）吸附柱內加入600 μL Buffer B，13000 r/min離心30 sec。
（8）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。
（9）重復步驟（7），（8）。
（10）13000 r/min空柱離心2 min，去除殘留液。
（11）將每個吸附柱分別移入新的1.5mL離心管中，向柱*加入50 μL Buffer C，室溫靜置1 min，13000 r/min離心30 sec，離心管中液體即為模板DNA。獲得的DNA溶液，冰上保存備用（注意提取的DNA須在2 h內進行PCR 擴增，若需長期保存須放置-80 ℃冰箱，但應避免反復凍融）。
3.2 熒光PCR擴增（使用B盒）
（1）從試劑盒中取出熒光PCR反應液、Taq酶，室溫融化后，2 000 r/min離心5 sec。設所需PCR管數為n（n = 樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應體系需要20 μL 熒光PCR反應液和0.5 μL Taq酶。計算好各試劑的使用量，加入一適當體積小管中，充分混合均勻后，向每個PCR管中各分裝20 μL。
（2）分別向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制備的DNA溶液各5μL，蓋緊管蓋，500 r/min 離心30 sec。
（3）將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內，作好標記。反應參數設置：
*階段，預變性95℃/3 min；第二階段，95℃/15 sec，52℃/10 sec，60℃/35 sec共45個循環。熒光收集在第二階段每次循環的60℃延伸時進行。
4.非洲豬瘟快速檢測試劑盒結果判定
4.1 結果分析條件的設定
閾值設定原則：根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線的高點為準。對于多通道熒光PCR儀，選定FAM(465-510)檢測通道讀取檢測結果，ABI儀器選擇FAM無熒光淬滅基團。
4.2 質控標準
4.2.1 陰性對照無Ct值并且無擴增曲線。
4.2.2 陽性對照的Ct值應小于等于28，并出現典型的擴增曲線。
4.2.3 如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實驗視為無效。
4.3 結果判定
4.3.1 陰性：無Ct值，且無特征性擴增曲線，表明樣品為陰性。
4.3.2 陽性：Ct值≤38.0，且出現典型的擴增曲線，表示樣品為陽性。
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