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非條件反射焦慮模型

一、 探究行為焦慮模型

1.大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze test in rats)

(1)復(fù)制方法  健康雄性大鼠，體重為200～250g。

十字迷宮裝置一般為木制結(jié)構(gòu)，并漆成黑色。包括2個(gè)50cm×50cm的相對(duì)開臂和2個(gè)50cm×10cm×40cm的相對(duì)閉臂。閉臂上部敞開，中央有一10cm×10cm的開闊部。2個(gè)開臂和2個(gè)閉臂呈十字交叉，迷宮離開地面的高度為50cm，故稱高架十字迷宮。

將大鼠置于中央開闊部，面向其中的一個(gè)閉臂。觀察者在1.0m以外記錄5min內(nèi)大鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)以及在兩臂滯留的時(shí)間(以四肢全部入臂或出臂為準(zhǔn))。計(jì)算大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)和時(shí)間分別占總次數(shù)(兩臂次數(shù)之和)和總時(shí)間(在兩臂滯留時(shí)間之和)的百分比，以此作為評(píng)價(jià)焦慮的指標(biāo)。通常這2個(gè)指標(biāo)呈高度相關(guān)。

為了減少無關(guān)刺激對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，在實(shí)驗(yàn)前5～7d每天撫摸動(dòng)物，并于實(shí)驗(yàn)前先將大鼠置于一敞箱中活動(dòng)5min，然后再放入迷宮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這樣可提高大鼠入臂的總次數(shù)，避免大鼠躲在閉臂，增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

(2)模型特點(diǎn)  此模型是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開臂的恐懼形成的矛盾沖突狀態(tài)，由 Montgomery的研究工作發(fā)展而來的。大鼠放入迷宮后會(huì)主動(dòng)探究開臂，但又懼怕開臂中高懸敞開的環(huán)境。抗焦慮劑增加大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)的百分比和在開臂滯留時(shí)間的百分比，但不改變?nèi)吮劭偞螖?shù)和總時(shí)間；致焦慮劑則在不影響總次數(shù)和總時(shí)間的劑量下使這2項(xiàng)指標(biāo)減少。

(3)比較醫(yī)學(xué)  此實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，評(píng)價(jià)抗焦慮作用的結(jié)果可靠，但比較費(fèi)時(shí)。此方法也可用于小鼠，并可得到與大鼠一致的結(jié)果。

2.大鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test in rats)

(1)實(shí)驗(yàn)方法

1)Stefanski法

復(fù)制方法  實(shí)驗(yàn)裝置為1只直徑80cm、高30cm的圓形敞箱，敞箱底部中央劃有直徑分別為35cm和50cm的內(nèi)、外兩個(gè)圓圈，內(nèi)圈所包含的區(qū)域?yàn)橹醒雲(yún)^(qū)。將大鼠置于中央?yún)^(qū)，觀察10min內(nèi)大鼠總的活動(dòng)次數(shù)、進(jìn)入開場(chǎng)中央的次數(shù)以及在開場(chǎng)中央?yún)^(qū)停留的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)在弱光照明、65dB白噪聲的條件下進(jìn)行。

2)開場(chǎng)飲水實(shí)驗(yàn)(open field drink test)

復(fù)制方法  實(shí)驗(yàn)裝置為1只36cm×36cm×36cm的透明有機(jī)玻璃方箱，頂部敞開，箱的左、右、后三側(cè)面及底部均為黑色，前側(cè)面無色透明以便觀察。箱的中央倒置懸掛一水瓶，瓶嘴離地面10cm，箱的上方離地面60cm處安置一盞25W的白熾燈。實(shí)驗(yàn)前3d大鼠限制飲水，每天僅于下午3：00～4：00給予飲水1h。同時(shí)需每天撫摸大鼠1min，以減少非特異性應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠置于開場(chǎng)中央，觀察動(dòng)物開始飲水的潛伏期、飲水時(shí)間、靠近水瓶的次數(shù)和站立數(shù)等指標(biāo)，觀察持續(xù)時(shí)間為10min。在每只大鼠實(shí)驗(yàn)后，需清潔實(shí)驗(yàn)箱，以防止嗅覺暗示影響下一只實(shí)驗(yàn)鼠。

(2)模型特點(diǎn)  動(dòng)物進(jìn)入敞箱后由于對(duì)新異環(huán)境具有恐懼心理，因此主要在敞箱內(nèi)的周邊區(qū)域活動(dòng)。但動(dòng)物的探究特性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)(如運(yùn)動(dòng)、飲水或進(jìn)食等)的動(dòng)機(jī)，因而形成沖突狀態(tài)。與大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，抗焦慮劑可解除這種沖突狀態(tài)，在不改變活動(dòng)計(jì)數(shù)的劑量下明顯增加大鼠進(jìn)入敞箱中央?yún)^(qū)域的次數(shù)以及在中央?yún)^(qū)域停留的時(shí)間(Stefanski法)，或增加大鼠在中央?yún)^(qū)域的飲水時(shí)間(open field drink test)，致焦慮劑則反之。

(3)比較醫(yī)學(xué)  開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易，因此在行為學(xué)研究中已普遍應(yīng)用，多用來評(píng)價(jià)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)活性等綜合行為。而作為抗焦慮模型，其穩(wěn)定性和可靠性還需進(jìn)一步驗(yàn)證，因此實(shí)驗(yàn)者丨好結(jié)合其他的焦慮模型綜合評(píng)價(jià)藥物的效應(yīng)。

3.明暗穿箱實(shí)驗(yàn)(light-dark transition test)

(1)復(fù)制方法  明暗穿箱實(shí)驗(yàn)可分別采用大鼠和小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其原理相似。

1)大鼠明暗穿箱實(shí)驗(yàn)  明暗箱(45cm×27cm×27cm)分明箱和暗箱2個(gè)部分。暗箱占1/3，頂部加蓋；明箱占2/3，頂部敞開，亮光照明。兩箱之間的隔板底部有一個(gè)7.5cm×7.5cm的門洞供動(dòng)物穿過。明暗箱與動(dòng)物活動(dòng)計(jì)數(shù)儀相連，可同時(shí)記錄動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)活性。動(dòng)物給藥后時(shí)間將其置于明箱中央，背對(duì)洞口，記錄10min內(nèi)動(dòng)物的穿箱次數(shù)以及分別在明箱和暗箱的滯留時(shí)間。

2)小鼠明暗穿箱實(shí)驗(yàn)  此處介紹一種Shimada改良法。 Shimada明暗箱的結(jié)構(gòu)為：在1只40cm×40cm×12cm的有機(jī)玻璃箱中央安裝一個(gè)20cm×20cm×12cm的透明有機(jī)玻璃小敞箱，在小敞箱的2個(gè)對(duì)角分別連有一個(gè)10cm×10cm×12cm的暗箱，暗箱的兩側(cè)各連有一個(gè)L型的跑道，暗箱與L型的跑道有一個(gè)3.5cm×3.5cm的洞口相通。裝置上方裝有攝像系統(tǒng)并連接視屏分析系統(tǒng)，以觀察小鼠的穿箱次數(shù)、在明箱滯留時(shí)間及運(yùn)動(dòng)活性。實(shí)驗(yàn)時(shí)使小鼠背對(duì)暗箱的洞口，記錄10min內(nèi)小鼠的穿箱次數(shù)及分別在明暗箱的滯留時(shí)間。

(2)模型特點(diǎn)  此實(shí)驗(yàn)是根據(jù)大鼠或小鼠喜歡在暗箱活動(dòng)，但動(dòng)物的探究習(xí)性又促使其試圖探究明箱而設(shè)計(jì)的。然而，明箱的光亮刺激又抑制動(dòng)物在明箱的探究活動(dòng)。抗焦慮作用可增加動(dòng)物在明箱的站立、滯留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)活性，增加穿箱次數(shù)，同時(shí)動(dòng)物在暗箱的上述指標(biāo)相應(yīng)減少，穿箱次數(shù)也減少。

(3)比較醫(yī)學(xué)  有抗焦慮作用的藥物均可增加動(dòng)物的穿箱次數(shù)及在明箱的滯留時(shí)間、站立和運(yùn)動(dòng)活性，非抗焦慮劑則無此作用。在此模型上抗焦慮劑的相對(duì)作用強(qiáng)度與臨床試驗(yàn)結(jié)果一致。此方法具有簡(jiǎn)便易行、對(duì)動(dòng)物施加的是無痛性刺激的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)為所需時(shí)間漫長(zhǎng)，早上和下午動(dòng)物的活動(dòng)性差異較大，建議實(shí)驗(yàn)放在下午進(jìn)行。

4.小鼠爬梯實(shí)驗(yàn)(staircase test in mice)

(1)復(fù)制方法  選用雄性小鼠，體重為18～22g。

實(shí)驗(yàn)裝置為一有機(jī)玻璃箱：長(zhǎng)45cm、寬10cm、一端高12.5cm、另一端高25cm，箱內(nèi)有5級(jí)高2.5cm、寬10cm的相同樓梯。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠置于箱的底部，使其背朝樓梯，記錄3min內(nèi)小鼠的站立數(shù)和爬梯數(shù)(以四肢都爬上樓梯為準(zhǔn))。實(shí)驗(yàn)需在安靜、光線恒定的環(huán)境下進(jìn)行。

(2)模型特點(diǎn)  此種方法篩選抗焦慮藥簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠，且由于小鼠的成本較低，因此實(shí)用于大規(guī)模篩選。為了簡(jiǎn)化觀察，不需考慮動(dòng)物下樓梯的級(jí)數(shù)。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需清潔實(shí)驗(yàn)箱，以排除嗅覺暗示對(duì)下一只動(dòng)物的干擾。    (3)比較醫(yī)學(xué)  爬梯實(shí)驗(yàn)用于探討動(dòng)物探索性行為或活動(dòng)性，動(dòng)物的爬梯作為評(píng)價(jià)動(dòng)物探究行為或活動(dòng)性的指標(biāo)，而直立則作為動(dòng)物焦慮狀態(tài)的參數(shù)。抗焦慮劑在不減少爬梯數(shù)的劑量使站立數(shù)減少，從而使這2個(gè)指標(biāo)分離。此外，能產(chǎn)生與藥物性焦慮變化無關(guān)的運(yùn)動(dòng)失調(diào)的藥物也可減少站立數(shù)，但同時(shí)也減少爬梯數(shù)。氟哌啶醇、抗抑郁藥以及其他能引起運(yùn)動(dòng)失調(diào)的藥物即可減少站立數(shù)，又可減少爬梯數(shù)。致焦慮劑并不產(chǎn)生與抗焦慮劑相反的結(jié)果，故評(píng)價(jià)致焦慮藥物時(shí)宜慎重。

5.小鼠四板實(shí)驗(yàn)(four plat test in mice)

(1)復(fù)制方法  選用雄性小鼠，體重為18～22g。

實(shí)驗(yàn)裝置為1只25cm×18cm×16cm的長(zhǎng)方形箱，箱的底部有4塊8cm×11cm的相同金屬板，各板間均有一4mm寬的間隙，4塊板均與電刺激器相連，處于對(duì)角線的2塊板同極，使小鼠每當(dāng)跨越上下或左右金屬板時(shí)受到一次電擊，電流強(qiáng)度為0.20～0.8mA。給藥后時(shí)間將小鼠置于板上，讓其探究15s后打開電刺激器。當(dāng)小鼠受到電刺激時(shí)產(chǎn)生明顯的逃避反應(yīng)，通常穿過2塊到3塊板便會(huì)停下，計(jì)為1次。記錄10min內(nèi)每分鐘的電擊數(shù)。

(2)模型特點(diǎn)  四板法以被動(dòng)回避為基礎(chǔ)，小鼠渴望探究，但又因害怕足電擊而使探究活動(dòng)受到抑制。抗焦慮劑可緩解或解除這種抑制狀態(tài)，使小鼠受電擊次數(shù)增多，神經(jīng)松弛劑等非抗焦慮藥則無此作用。

(3)比較醫(yī)學(xué)  該方法操作簡(jiǎn)便，不需訓(xùn)練動(dòng)物，因此廣泛用于抗焦慮藥物的篩選。然而，有些興丨奮丨劑(如苯丨丙丨胺)也可增加懲罰性跨板數(shù)(電擊數(shù))，有些抗焦慮劑反而無效。因此需結(jié)合其他焦慮模型的試驗(yàn)結(jié)果綜合評(píng)價(jià)。

二、 大鼠群居接觸模型(Model of social interaction test in rats)

(1)復(fù)制方法  選用雄性大鼠，體重為200～250g。

實(shí)驗(yàn)裝置為1只60cm×60cm×35cm的木箱，箱內(nèi)壁漆成黑色。箱的上部懸掛一盞白熾燈，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)需要調(diào)節(jié)燈的功率大小或懸掛高度。大鼠于實(shí)驗(yàn)前單養(yǎng)5～7d。實(shí)驗(yàn)時(shí)按體重相近原則兩兩配對(duì)，配對(duì)大鼠的體重一般相差不超過15g，配對(duì)的2只大鼠藥物處理相同。實(shí)驗(yàn)在4種條件下，分兩階段進(jìn)行。這4種條件分別是：強(qiáng)光(300lx)照射、弱光(30lx)照射、動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)箱熟悉、動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)箱不熟悉。由此可組合為4種不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，即強(qiáng)光不熟悉、強(qiáng)光熟悉、弱光不熟悉、弱光熟悉。階段實(shí)驗(yàn)是在大鼠不熟悉實(shí)驗(yàn)箱的條件下，分別測(cè)定10min內(nèi)配對(duì)大鼠在強(qiáng)光和弱光環(huán)境下的主動(dòng)接觸時(shí)間。主動(dòng)接觸包括嗅、追、推、踢、騎跨、理毛、爬或鉆、扭打、格斗等，而被動(dòng)的依靠則不計(jì)入在內(nèi)。若在箱的側(cè)壁上裝有紅外光電管，還町同時(shí)觀察動(dòng)物的活動(dòng)數(shù)和站立數(shù)。接著將大鼠單個(gè)放在箱內(nèi)，使之在自然光的條件下每天熟悉實(shí)驗(yàn)箱10min，連續(xù)2d。接下來進(jìn)行第二階段強(qiáng)光和弱光熟悉實(shí)驗(yàn)，觀察時(shí)間和指標(biāo)與階段相同。

(2)模型特點(diǎn)  此模型是基于大鼠在一個(gè)陌生的環(huán)境沒有建立自己的領(lǐng)地，表現(xiàn)出渴望接觸的動(dòng)機(jī)而設(shè)計(jì)的。采用新異環(huán)境和強(qiáng)光條件作為致焦慮刺激，從而建立起大鼠群居相互接觸焦慮模型。未經(jīng)藥物處理的大鼠，其主動(dòng)接觸時(shí)間在弱光熟悉多于強(qiáng)光不熟悉，而強(qiáng)光熟悉與弱光不熟悉則介于兩者之間。

為了排除群居接觸變化由一般刺激或鎮(zhèn)靜效應(yīng)引起的可能性，應(yīng)同時(shí)測(cè)定動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)活性(如開場(chǎng)實(shí)驗(yàn))。此模型選用小鼠很難達(dá)到預(yù)期的效果，因此該方法不適宜選用小鼠。

(3)比較醫(yī)學(xué)  由于該模型不需要訓(xùn)練動(dòng)物，也沒有剝奪飲食或外加電擊等惡性刺激，且穩(wěn)定可靠，因此是目前焦慮研究中使用多的模型之一。但不同類型的抗焦慮劑在此模型上的表現(xiàn)不相同。如：BDZ類藥物增加強(qiáng)光或不熟悉環(huán)境下大鼠的主動(dòng)接觸時(shí)間，而在弱光熟悉條件下的作用極小；巴比妥類藥物則在4種條件下都使主動(dòng)接觸增多。這兩類藥物的這種作用差別意義還不清楚。致焦慮劑則減少大鼠的主動(dòng)接觸時(shí)間。此模型的不足之處尚有：①由于使用配對(duì)動(dòng)物，一個(gè)動(dòng)物的行為都嚴(yán)格依賴于其配對(duì)同伴的行為，因此很難檢測(cè)單個(gè)動(dòng)物在行為上的差異。②動(dòng)物消耗多。

三、  Vogel沖突實(shí)驗(yàn)(Vogel conflict test)

(1)復(fù)制方法  選用雄性大鼠，體重為200～250g。

實(shí)驗(yàn)裝置為Model-102型焦慮儀(美國(guó)Lafayette儀器公司)，由自動(dòng)計(jì)數(shù)器、電刺激器和有機(jī)玻璃操作箱三部分組成。操作箱尺寸為45cm×24cm×21cm，其底部為不銹鋼柵條，條間距離為1cm。頂部蓋為一網(wǎng)眼狀不銹鋼蓋，頂蓋的一端插入一個(gè)水瓶，瓶嘴為不銹鋼材質(zhì)。瓶嘴深入箱內(nèi)6cm，距離底部柵條10cm，并與底部柵條一起通過導(dǎo)線與刺激器相連。瓶嘴外套*緣膠皮，以防大鼠觸及瓶嘴但未舔水時(shí)遭受電擊。

實(shí)驗(yàn)分兩階段進(jìn)行。階段為非懲罰飲水訓(xùn)練：大鼠禁水24h后被單獨(dú)置于操作箱，讓其充分探究，直到發(fā)現(xiàn)瓶嘴并開始舔水。計(jì)數(shù)器自動(dòng)記錄大鼠在3min內(nèi)的舔水次數(shù)，對(duì)舔水少于300次的大鼠予以淘汰。第二階段為懲罰實(shí)驗(yàn)：未被淘汰的大鼠繼續(xù)禁水24h后再次被單獨(dú)置于操作箱。經(jīng)過階段的訓(xùn)練，大鼠能很快找到瓶嘴并開始舔水。舔夠20次儀器自動(dòng)開始計(jì)時(shí)并給予一次電擊(舔水與電擊次數(shù)之比為20：1)，電擊強(qiáng)度一般為0.2～0.5mA，持續(xù)2S，但大鼠可通過脫離瓶嘴來控制受電擊時(shí)間的長(zhǎng)短。記錄懲罰期(也是3min)大鼠的舔水次數(shù)。

(2)模型特點(diǎn)與比較醫(yī)學(xué)  此模型是Vogel等根據(jù)前人經(jīng)驗(yàn)，研究設(shè)計(jì)出的一種簡(jiǎn)單飲水模型，為非條件沖突實(shí)驗(yàn)，并成功地用于抗焦慮藥物的篩選。其建立依據(jù)為：禁水大鼠的飲水動(dòng)機(jī)與它同時(shí)所遭受的足電擊懲罰形成矛盾沖突狀態(tài)。抗焦慮藥物增加懲罰期大鼠的舔水次數(shù)，致焦慮劑則使之降低。但是，影響藥物自發(fā)飲水的藥物可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，因此有測(cè)定大鼠自發(fā)飲水量的變化。方法是：在第二階段的懲罰期不加電擊，記錄3min的舔水次數(shù)。在評(píng)價(jià)抗焦慮藥物時(shí)，電流強(qiáng)度應(yīng)偏小(以0.25～0.35mA為宜)；評(píng)價(jià)致焦慮藥物時(shí)，電流強(qiáng)度可偏大。