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上海申知心生物科技有限公司
主營(yíng)產(chǎn)品： 高血脂癥動(dòng)物模型,心血管疾病動(dòng)物模型,缺血性心臟病動(dòng)物模型 |
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選方法是堿裂解法。如果有問(wèn)題，或者是大質(zhì)粒 (>15 kb)，則用溫和的方法 SDS 裂解法。詳細(xì)情況見“分子克隆”。試劑盒都使用堿裂解法，所以都有一個(gè)通病，抽提大質(zhì)粒時(shí)效果不好。
質(zhì)粒抽提常用的方法是堿裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特點(diǎn)。關(guān)于堿裂解法的原理，復(fù)旦大學(xué)生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的有一篇專論，大家可以去看一下。這是一篇美文，非常有趣。文中提到了一個(gè)與能查到的資料不同的觀點(diǎn)，也是非常有啟發(fā)的。
當(dāng)然，堿裂解法相對(duì)質(zhì)粒抽提也有缺陷：容易導(dǎo)致不可逆的變性；不適合大。堿裂解法是很劇烈的方法，質(zhì)粒在堿性條件下會(huì)變性，時(shí)間一長(zhǎng)，這種變性就成為不可逆的了 (電泳時(shí)在超螺旋前面一點(diǎn)點(diǎn)，如果有一條帶，就是此變性的質(zhì)粒。)。所以，要降低不可逆的變性，就要控制好堿裂解的時(shí)間。 (似乎可以做這么一個(gè)推理：在堿性條件下，質(zhì)粒的兩條鏈從一點(diǎn)或者幾個(gè)點(diǎn)開始分開，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，直到分開。理論上講，分開的兩條鏈要很快地配對(duì)復(fù)性，成功率不可能是 的，而沒(méi)有分開的兩條鏈卻可能 配對(duì)復(fù)性。) 堿裂解法不適合大，原因也是因?yàn)樵摲椒ㄌ珓×遥钩菪壤^低。文獻(xiàn)推薦的抽提大質(zhì)粒的方法是溫和得多的方法，缺點(diǎn)是得率要低一些。現(xiàn)在得問(wèn)題是，大質(zhì)粒的拷貝數(shù)本來(lái)就低，如果抽提方法得率再不高的話，抽提起來(lái)就很費(fèi)力了。如果注意到在堿裂解法中，超螺旋比例隨著堿裂解時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，隨著粘稠度的增加而減低這個(gè)現(xiàn)象，可以使用堿裂解法來(lái)抽提大質(zhì)粒的：增加試劑的使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分鐘內(nèi)就能變得很清澈；立即加入中和試劑。這個(gè)實(shí)驗(yàn)我們沒(méi)有做過(guò)，但 QIAGEN 抽提大質(zhì)粒用的就是堿裂解法。
