NanoView公司所開發的全自動外泌體熒光檢測分析系統是一款無需純化的、全自動的可對單個外泌體進行表征分析的全新設備。該設備能夠提供全面的外泌體表征信息，包括外泌體粒徑大小、計數、分布、攜帶蛋白表達、生物標志物（CD9，CD81，CD63等）共定位等。操作簡單，結果可靠。一經推出，便引起了外泌體領域科研工作者的廣泛關注，短短兩年時間在全球已有50多個實驗室采用該技術，發表重要文獻近百篇。

全自動外泌體熒光檢測分析系統基本原理是一種基于特異性免疫捕獲技術，允許研究者直接分析特定群體的外泌體或外囊泡。通過配套的試劑盒，客戶一次性能夠分析多達9個不同的樣本，大大節省了時間和經濟成本。兼容各種生物樣本，除了純化的外泌體之外，對于血液、尿液、惡性腫瘤、腹水中的外泌體也可直接檢測分析，大大拓展了研究范圍

應用方向及主要特征

生物標記物共定位 最多可量化4種標記物的表達情況	計數分析 直接從樣品中計算抗原陽性外泌體的數量，無需提純
粒徑分析 高精度統計外泌體的顆粒大小及分布	檢測外泌體內容物 使用ExoView Cargo試劑盒可探測外泌體內部核酸的裝載情況，分析裝載率
熒光檢測 具備3個熒光通道，能夠探測單個蛋白的結合	線性工作流程 最高9個樣品的全自動分析
無須純化 無需擔心純化帶來的誤差，更精確的測量樣品間的表征和表達信息的差異	多重樣本分析 最多可使用6種表面標記物來篩選外泌體

外泌體粒徑分析

能夠對>50 nm的外泌體進行全方面的表征，無論是粒徑尺寸、粒徑分布還是外泌體的亞型均可在一次測試中得到。并且所用來測試的樣本無需進行純化，避免因純化帶來的樣本偏差。

分析不同大小和不同尺度的外泌體亞群，在CD171過表達系統中，100 nm以上的外泌體僅表達了CD171。

量化外泌體亞群

通過抗體捕獲的模式，能夠量化含有不同標記物的外泌體亞群，并對不同種群的外泌體進行特異性計數和分析。整個過程無需純化，并且線性范圍可跨越3個數量級。

TSPAN8陽性細胞外囊泡的稀釋曲線。使用1:3比例的梯度稀釋。用R2 = 0.9986計算與TSPAN8熒光數據的線性擬合。

檢測外囊泡中的裝載物

MISEV建議在表征外泌體和外囊泡時，應當同時測量表面和載體蛋白。使用ExoView芯片可穿透外泌體，探測膜內蛋白和載體。并且單次可定量3種表面、管腔蛋白。

檢測細胞外泌體內的Syntenin。

WT細胞在未穿膜的條件下幾乎觀測不到Syntenin的信號。進行穿膜處理后可以觀測到Syntenin信號，而KO之后信號消失

生物標志物共定位

能夠在單個外泌體樣本上檢測多達4種標記物，并同時提供外泌體的其它表征數據諸如計數、顆粒尺寸統計等。

無需純化

只測量含有靶標抗原的特定細胞外泌體群體。僅需35 μL的稀釋樣品，即可直接獲得外泌體的表型、粒徑和計數信息。并且無需擔心污染物對測試的影響。

無論純化與否，Exoview均可進行分析

ExoView™ Kit 配置清單:

應用案例：

對不同體液中小RNA測序以篩選最佳的胞外RNA提取方法

exRNA profile會受到不同來源（細胞/組織），不同狀態（年齡/健康程度/器官狀態）的影響，且由包括外泌體在內的不同的載體運輸，加上不同的提取方法和檢測技術，均會影響exRNA profile的測定結果。現今的小RNA測序方法已經可以準確地表征exRNA profile，因此合適的exRNA提取方法便至關重要。Srinivasan[1]等通過使用多種exRNA分離方法分離不同位點獲得的5種體液中的外泌體，分析結果后總結出了不同體液的適合分離方法。

其中，研究人員使用單個外泌體表型分析技術(Exoview)檢測了來源于人血漿的外泌體的蛋白marker表達，判斷出血漿外泌體根據蛋白marker主要分為CD63-/CD81+/CD9+和CD63+/CD81+/CD9+兩種。

人血漿外泌體蛋白表達分析

參考文獻：[1] Srinivasan, S., Yeri, A., Cheah, P. S., Chung, A., Danielson, K., De Hoff, P., ... & Laurent, L. C. (2019). Small RNA sequencing across diverse biofluids identifies optimal methods for exRNA isolation. Cell, 177(2), 446-462.

Brain Behavior and Immunity：脊髓損傷導致血清神經炎癥相關納米顆粒中miRNA與CD81+外泌體水平的改變

脊髓損傷（SCI）會對機體產生系統性影響，導致呼吸、免疫、消化等功能異常，以及相關腦區產生神經炎癥和退行性病變。有研究表明，SCI的病理與系統性影響可能與血液來源的因子如外泌體的運輸有關；而在中樞神經系統損傷模型中，外泌體可能參與了miRNA等炎性因子運輸導致炎癥擴散。Khan等[1]使用包括Exoview外泌體表型分析的多種技術詳細表征了SCI建模的小鼠血漿外泌體，發現損傷后外泌體數量、蛋白marker和內容物均有明顯的變化，將SCI小鼠的外泌體注射入腦室還可誘發產生炎癥。

研究人員使用ExoView檢測了SCI血漿外泌體的粒徑、數量、熒光強度和共定位（圖1A）。外泌體在CD81和CD9區域產生特異性結合而被捕獲，而沒有CD63捕獲。根據干涉成像獲得外泌體尺寸分布，其中在50nm最多（圖1B&C）。熒光成像則檢測到了大量干涉成像檢測不出的尺寸小于50nm的外泌體（圖1D&E），CD81和CD9在大量外泌體上表型出熒光共定位，而CD63熒光則未被檢測到，這與圖1C結果一致（圖1F-H）。相比之下，NTA與流式分析無法檢測到尺寸小于50nm的外泌體。

圖1 ExoView檢測血漿外泌體的粒徑、數量、熒光強度和共定位

研究人員進一步比較了SCI組和對照組的血漿外泌體變化，結果表明，在損傷后1d的時間點，CD81外泌體數量相對對照組更高，與Western Blot的結果一致；而CD9外泌體數量則沒有統計學差異，與流式分析的結果一致（圖2A&B）。基于圖2H的CD81與CD9有大量的熒光共定位，檢測CD9外泌體的CD81熒光強度，由1d的熒光強度中位數差異可知，

圖2 ExoView檢測血漿外泌體的粒徑、數量、熒光強度和共定位

參考文獻：[1] Khan, N. Z., Cao, T., He, J., Ritzel, R. M., Li, Y., Henry, R. J., ... & Wu, J. (2020). Spinal cord injury alters microRNA and CD81+ exosome levels in plasma extracellular nanoparticles with neuroinflammatory potential. Brain, behavior, and immunity.

Cells：CD44糖蛋白在胃癌發生中的作用

CD44是一種跨膜糖蛋白，能夠介導細胞間與細胞-基質間相互作用，主要配體為透明質酸（HA）。研究表明，CD44與腫瘤的生長相關，其在腫瘤細胞中高表達，且CD44與HA的結合親和力高，因此納米載體常用HA做表面修飾以作為腫瘤細胞的靶向藥物載體。外泌體是天然的靶向信息傳遞載體，有研究在外泌體中檢測到CD44。H?rk?nen等[1]使用胃癌細胞MKN74研究了CD44表達對外泌體分泌，HA合成與腫瘤細胞生長的影響。結果表明，CD44促進了細胞表面和細胞間的HA形成，調控腫瘤微環境；CD44可改變外泌體的物理性質以及靶向性質。

其中，研究人員使用Exoview檢測了MKN74細胞的未經純化的培養基及分離純化后的外泌體中的含CD44以及其他標記物的含量。結果表明，相對于對照組，MOCK（CD44敲除）細胞組在未經純化的培養基及分離純化后的分泌外泌體的數量顯著降低。以上結果表示ExoView可以直接對復雜環境的培養基進行檢測，無需分離純化步驟，且檢測結果具有*特異性。

ExoView檢測表達不同蛋白標記物的外泌體數量

參考文獻：[1] H?rk?nen, K., Oikari, S., Kyykallio, H., Capra, J., Hakkola, S., Ketola, K., ... & Rilla, K. (2019). CD44s assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma cells. Cells, 8(3), 276.

Cancer Cell Int：外泌體與miRNA調節成神經管細胞瘤的干細胞性

腦瘤中部分細胞具有干細胞特性，能夠自我更新并分化為不同細胞系。其中，成神經管細胞瘤的病人有25%經過傳統療法后5年內復發并轉移導致死亡，存活的病人也受到治療副作用和并發癥影響，因此需要一種安全有效的治療方法。腫瘤細胞的外泌體含有miRNA，能夠調節細胞增殖、分化、代謝、凋亡等生理過程并與抗藥性相關。有研究表明腫瘤干細胞的外泌體運載了腫瘤細胞*的miRNA，能夠產生有利于腫瘤發展的微環境。Choi等[1]研究了成神經管細胞瘤的外泌體及運載的miRNA及其在腫瘤康復中的潛在作用。其中，miR-135b和miR-135a在腫瘤干細胞中高表達，抑制兩者會導致具有腫瘤抑制作用的Angiomotin?like 2（AMOTL2）表達上升，使腫瘤干細胞的干細胞特性下降。

其中，研究人員使用ExoView通過熒光成像檢測腫瘤細胞與腫瘤干細胞的外泌體標記物，在兩種細胞的外泌體上均檢測到了Alix和Syntenin兩種內蛋白，并且可以確定兩種內蛋白與CD63/CD9外泌體標記物共定位。

Exoview檢測外泌體上的Alix（a）與Syntenin（b）蛋白

參考文獻：[1] Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J. H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated miR-135b and-135a regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

ExoView外泌體全面表征試劑盒