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想做好血液RNA-seq實驗？這些經驗請收好！
閱讀：178發布時間：2024-12-20
血液是一種信息量巨大、獲取方便且微創的樣本類型，廣泛用于診斷和臨床研究，以探索疾病的病理和生理機制以及療法的作用。全血轉錄組測序是一種基于RNA測序（RNA-Seq）的方法，可對全血進行深入的基因表達譜分析，深入了解全系統范圍內所有轉錄本的表達和豐度。高通量RNA-Seq技術的發展使我們能夠以較低的成本收集高質量的血液轉錄組信息，為發現生物標志物、了解藥物反應、病理和生理過程以及疾病的無創診斷帶來了革命性的變化。
外周血的優勢在于采集快捷，且可在大規模人群中實現。然而，一旦血液離開人體，問題就來了。傳統方法需要從全血中分離白細胞，再提取RNA，以解決血液中污染物的問題。如今，專門為制備血液樣本而開發的方案使我們能夠從全血中獲得高質量的RNA-Seq 數據。
什么是RNA-seq？
RNA-seq即轉錄組測序技術（Transcriptome sequencing），廣義的定義為：對細胞內所有RNA（包括rRNA/ tRNA/ mRNA等）進行高通量測序，狹義的定義為：對細胞內mRNA進行高通量測序，臨床檢驗實驗室指的一般為狹義的轉錄組測序。
血液樣本
任何血液轉錄組分析實驗的第一步都是通過靜脈穿刺或指針采血。從少量血液中獲取優質RNA的技術進步，如通過指針采樣，將使廣泛的研究成為可能，參與者甚至可以進行自我采樣。
血液RNA降解可能發生在采集、儲存和處理過程中，因此，血液排出體外后，必須防止或減少RNA降解。而血液RNA極易降解的原因之一是血漿中含有高濃度的RNA酶（RNase）。在一項研究中，血漿內的游離RNA僅在15 秒鐘就發生降解，導致無法進行實時PCR擴增，RNA酶的威力由此可見一斑。因此，在采集全血時立即抑制RNA酶的活性至關重要，這樣才能確保采集高質量的RNA，這對下游測序、生物標記物鑒定和疾病診斷至關重要。
為了降低RNA的降解，特別是在開展大規模血液轉錄組學項目時，我們建議使用專門RNA采血管收集血液，如PAXgene™全血RNA 采血管（BD, 762165）。該采血管含有能穩定 RNA 的專有試劑，能產生準確反映采樣時血液狀態的基因表達數據。
更重要的一點，采血管的樣本儲藏時間及RNA質量的穩定性，是大型多中心臨床研究的一個關鍵考慮因素。PAXgene全血RNA保存管（762165）內含能夠穩定體內基因轉錄性狀的抗凝劑。抗凝劑能夠減少RNA在體外的降解，穩定細胞內的RNA，并將基因誘導的水平降低到最小程度，被廣泛用于血液RNA樣本的保存。相關實驗證明，PAXgene™ 全血RNA 采血管中樣本在-80℃儲存7年后 ，提取的RNA 質量與產量均較穩定，樣本在-20℃中儲存11年后，RNA 質量與采集當天相比沒有降低。
PAXgene™ 血液RNA管附帶有配套的RNA提取方案（Qiagen，cat.762331），也可以使用不同的RNA提取方案進行分離，例如使用苯酚/氯仿提取，或與血液樣本兼容的其他方案。
細胞壁被破壞后，裂解液中不僅含有RNA，還含有DNA和蛋白質。基因組DNA（gDNA）是"雜質"之一，會在數據分析步驟中造成偏差和定量問題。然而，由于血細胞中DNA的含量高于RNA，一般會對從血液中分離出來的RNA使用DNase進行處理。
在開始制備RNA-Seq文庫之前，是否需要進行任何RNA 預處理在很大程度上取決于實驗設計、所選文庫預處理和樣本類型。在從血液中分離出的RNA樣本中，有兩個重要的"雜質"占據了很大的測序空間，它們是珠蛋白mRNA和核糖體RNA（rRNA）。
紅細胞中的珠蛋白mRNA量可占樣本中所有mRNA的 30-80%，而rRNA 則占總RNA的80-90 %。在mRNA-Seq實驗中，經過poly(A)選擇后，這些轉錄本會消耗很大比例的測序讀數。此外，它們還影響了對血液轉錄譜的分析。
另外，如下圖所示，在沒有珠蛋白耗竭的情況下，基因檢測率會降低。從血液中分離的RNA樣本中去除rRNA及珠蛋白mRNA，可釋放出更多寶貴的測序空間，并將測序讀數集中到最重要的部分。
全血是一種珍貴、易得的樣本類型，也是制備血液RNA-Seq的樣本。不同的實驗設計和RNA-Seq類型，從全血中獲取高質量RNA-Seq數據的步驟會有所不同。無論選擇哪種方法，最佳實踐建議都是在采樣后立即滅活RNase以防止RNA降解；用DNase處理RNA樣品以去除gDNA，去除球蛋白mRNA以提高基因檢測率，如果是mRNA-Seq或總RNA-Seq，則同時去除rRNA，以釋放額外的測序空間。
實驗小貼士：少走彎路更高效
嚴格操作規范：RNA-seq實驗中稍有不慎便會影響結果，請確保每一步均符合標準操作規程。
批量處理樣本：為減少批次間誤差，建議一次性處理多個樣本，統一條件操作。
數據備份：測序數據是寶貴資產，請及時備份以防丟失。
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