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去內(nèi)毒素質(zhì)粒DAN提取試劑盒

原理簡(jiǎn)介

本試劑盒在常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)，增加內(nèi)毒素清步驟，提取的質(zhì)粒可用于一些要求更高的實(shí)驗(yàn)，如轉(zhuǎn)染。
本試劑盒（以200T為例）可以用200小次或者*次提取。

注意事項(xiàng)
1．溶液Ⅱ低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以37度水浴幾分鐘即可恢復(fù)澄清透明。用完請(qǐng)及時(shí)蓋緊蓋子。
2．溶液Ⅰ中加入RNase 后請(qǐng)放2-8度保存，如果長(zhǎng)久不用（如一個(gè)月），可-20度凍存，或者按照比較分次加入。
3．可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況中量或者大量提取，加入的試劑等比放大。
4．內(nèi)毒素清除劑在常溫下出現(xiàn)面混濁現(xiàn)象，為正常，在2-8℃放置一段時(shí)間混濁會(huì)消失。
5．本試劑盒在去除內(nèi)毒素的過(guò)程中會(huì)損失少量質(zhì)粒，因而相對(duì)于常規(guī)提取，本試劑盒得率偏低。

操作步驟(以小量提取為例,中提或者大提可等比例加入)
在溶液Ⅰ中加入RNaseA，混勻，2－8度保存。
1．取過(guò)ye菌1-5毫升，5000g離心1分鐘收集細(xì)菌沉淀，棄上清（可重復(fù)多次收集于一管中，收集量可考慮菌液濃度與質(zhì)粒拷貝數(shù)），如為陽(yáng)性細(xì)菌，可加入100mg/ml的溶菌酶懸浮菌液，37度處理30分鐘，離心，收集沉淀。
2．在收集的菌液中，加入200ul溶液I，重懸細(xì)菌沉淀。確保沉淀*散開(kāi)，無(wú)可見(jiàn)細(xì)菌團(tuán)塊(可vortex 5-10秒或更長(zhǎng)時(shí)間)。室溫放置2-3分鐘。
3．每管加入200ul溶液Ⅱ（如有沉淀，可37度水浴），輕輕顛倒離心管4-6次，使細(xì)菌*裂解，溶液透明。放置2-3分鐘，不過(guò)超過(guò)5分鐘。但也不要混勻后立刻加入溶液Ⅲ。
4．放置2-3分鐘后，每管加入200ul溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見(jiàn)白色絮狀物產(chǎn)生。
5．zui高速(13,000rpm左右)室溫離心5分鐘。
6．將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，如有沉淀，可再次離心。
7．加入上清1/5體積冰預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑，振蕩混勻，溶液變渾濁，冰浴2min至溶液變清亮。
8．37℃水浴2min，不時(shí)振蕩，溶液又變渾濁。12000rpm室溫離心2min，溶液應(yīng)分為兩相，上層水相含質(zhì)粒DNA，下層油狀相含內(nèi)毒素。
9．將含質(zhì)粒DNA的上層水相轉(zhuǎn)移至新管，棄下層油狀相，注意不要吸入油狀相。重復(fù)抽提三次，即重復(fù)步驟7-9三次。
10．在得到的上清中加入等體積的結(jié)合液，再加入等體積的無(wú)水乙醇，混勻（上清：結(jié)合液：無(wú)水乙醇＝1：1：1）
11．玻璃奶搖勻。取20ul混勻的玻璃奶加入上面的混合液中，混勻。室溫放置5分鐘，期間顛倒2次。
12．10000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，倒掉上清；沉淀加入1ml 70%乙醇，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，去上清，70%乙醇重復(fù)洗一次，再用無(wú)水乙醇洗一次。去上清，再次離心2分鐘，用小吸頭吸去上清。
13．室溫放置10分鐘（如果為大提，請(qǐng)延長(zhǎng)放置時(shí)間到30分鐘，此步為去除殘余酒精，以免影響下游實(shí)驗(yàn)），加入30－50ulTE緩沖液混勻溶解，55℃水浴5分鐘。離心，取上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中。此為所提質(zhì)粒。
14．電泳或者其他方法檢測(cè)，進(jìn)入下游實(shí)驗(yàn)。