黃曲霉毒素B1酶聯免疫測試盒 96孔板

黃曲霉毒素B1（AFB1）的檢測

方法一  試紙卡法

1. 適用范圍與檢測意義：本品適用于谷物、飼料、食用油、調料和發酵酒等物質中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1簡寫為AFB1）的快速檢測。黃曲霉毒素B1是目前已知的化學物質中致癌性很強的一種，對人和若干動物具有強烈的毒性，其毒性作用主要是對肝臟的損害。黃曲霉毒素B1是大部分食品的必檢項目之一。

2. 測定原理：本品采用高度特異性抗體抗原反應及免疫層析分析技術，通過單克隆抗體競爭結合AFB1-BSA偶聯物和樣品中可能含有的AFB1的原理。試劑含有被事先固定于膜上測試區（T）的AFB1-BSA偶聯物和被膠體金標記的抗AFB1單克隆抗體。檢出限為5ng/ml。

3. 所用器皿：常量天平±0.1g；蒸發皿或燒杯；量筒；滴管；移液管；小型粉碎機；離心機等。

4. 樣品制備：

4.1 谷物：任取5g以上有代表性樣品并充分碎，準確稱取2.0g均勻粉碎試樣于配套離心管中，再準確加入4ml純凈水和4.0ml的乙酸乙酯，將瓶塞蓋緊密封，充分振蕩5min，離心得上清液，將上清液用吸管吸出2.0ml到蒸發皿或小玻璃杯中，用電吹風吹干上清液，再根據樣品的種類用以下規定的稀釋液量用鋁箔袋內配套吸管反復沖洗，*溶解杯底所有的固體，此溶解液為樣品提取液即檢測液。考慮不同樣品對黃曲霉毒素B1的zui高含量要求，可參考下表用稀釋液溶解杯底固體：

谷物殘留*（ppb）
 2.5
 5
 10
 20
 
使用稀釋液體積（ml）
 0.4
 0.8
 1.6
 3.2
 

4.2 飼料（以殘留*50ppb計算）：任取5g以上有代表性樣品并充分粉碎，準確稱取2.0g均勻粉碎試樣于配套離心管中，再準確加入4ml純凈水和4.0ml的乙酸乙酯，將瓶塞蓋緊密封，充分振蕩5min，離心得上清液，將上清液用吸管出0.5ml到蒸發皿或小玻璃杯中，用電吹風吹干上清液，再用2ml的稀釋液量用鋁箔袋內配套吸管反復沖洗，*溶解杯底所有的固體，此溶解液為樣品提取液即檢測液。如果殘留*是30ppb，則用1.2ml的稀釋液溶解；如果殘留*是40ppb，則用1.6ml的稀釋液溶解。

4.3 食用油：稱取2.0g油樣于小燒杯中，用8ml正己烷分次將試樣轉移至分液漏斗中，準確加入4ml純凈水充分振蕩3min,吸去上層正己烷層,再加入4ml的乙酸乙酯，將瓶塞蓋緊密封，充分振蕩5min，靜置或離心得上清液，將上清液吸出2ml到小玻璃杯中，用電吹風吹干，再用稀釋液溶解后為樣品提取液。

4.4 醬油、醋、發酵酒：稱取25.0g樣品于小燒杯中，用5ml蒸餾水將試樣轉移到分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經盛有約5g預先用三氯甲烷濕潤的無水Na2SO4過濾器于蒸發皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重復振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發皿中，zui后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發皿中，用電吹風吹干。吹干冷卻后，準確加入稀釋液，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。

5  測定

5.1 使用前將試紙卡和待檢樣本溶液恢復至室溫。

5.2 從原包裝袋中取出試紙卡，打開后平放在桌面上，在1小時內盡快地使用。

5.3 用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加3滴于加樣孔中，加樣后開始計時。

5.4 結果應在10min時讀取，超過12min的時間判讀無效。

6 結果判定

6.1 陽性：C線顯示出紅色線條，T線不顯色，或C線顯示出紅色線條，而T線顏色非常模糊時，判為陽性。表明：AFB1含量超過樣品允許量。

6.2 陰性：C線顯示出紅色線條，T線同時顯示出紅色線條，且T線顏色接近C線或者深于C線時，判為陰性。表明：AFB1含量低于樣品允許量。

6.3 無效：C線不顯示出紅色線條，而T線顯示出紅色線條，該試紙卡判為無效。建議使用新的試紙卡重新測試。

7 說明

7.1 勿觸摸試紙顯示區。

7.2 發現過期，破損，污染時不可再用。

7.3 本品應保存在干燥陰涼處（4-30℃），有效期18個月，生產日期見包裝。

7.4 本品為一次性產品，勿重復使用。

7.5 如遇稀釋液不足，可用蒸餾水加入稀釋液中混勻后使用。

7.6 本品為篩選方法，任何陽性結果請用其它方法作進一步確認。

7.7 有條件的實驗室可以用AFB1標準品作為判斷參考。

方法二 酶聯免疫定量檢測試劑盒法

本測試盒用間接競爭免疫分析法定量測定谷物中AFB1。該測試盒反應孔可拆卸，可測單份樣品，也可測多份樣品。定量分析時需有含450nm波長的微孔板酶標儀。

1 概要

黃曲霉毒素是由曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產生的次級代謝產物，主要污染玉米、花生、堅果等。天然污染的黃曲霉毒素以AFB1為主，AFB1屬于強烈致癌物質，肝臟是其主要的靶器官，具有*的急性毒性和致癌性。

AFB1檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）和ELISA方法，本試劑盒是以應用單克隆抗體為基礎的ELISA檢測方法，可以準確快速檢測糧谷類和花生及飼料中的AFB1。

2 測定原理

本試劑盒采用固相酶聯免疫吸附原理，利用間接競爭ELISA法進行測定。用抗原包被微孔板，加入AFB1標準品或樣品、抗AFB1單克隆抗體進行孵育后，將未與包被抗原結合的抗體洗去；再加入酶標記的抗鼠IgG抗體孵育，加入顯色液，經過終止液終止后，用酶標儀在450nm處測定OD值。

3 提供的物品

----微孔板…………………………………………………………… 包被有AFB1-BSA

----5個濃度的AFB1標準溶液（各0.5mL）

標準1：0ng/mL…………………………………………………………….直接使用

標準2：0.1ng/m…………………………………………………………….直接使用

標準3：0.2ng/mL ………………………………………………………….直接使用

標準4：0.5ng/m………………………………………………….…………直接使用

標準5：1.0ng/m………………………………………….…………………直接使用

----抗AF B1單克隆抗體溶液（6mL）……………………………………………直接使用

----酶標物（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----顯色液（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----終止液（6mL）…………………………………………………………………直接使用

----濃縮洗液（30mL）..……………………………………………………………稀釋使用

4 盒中未提供，需自備物品

----微孔板酶標儀（可于450nm處測定）、振蕩器、粉碎機、微量移液器

----量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙

----氯化鈉（分析純）、甲醇（分析純）、去離子水或蒸餾水

5 操作者注意事項

        ----標準溶液中含有黃曲霉毒素，應特別小心。

----使用過的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液用pH7的次氯酸溶液（10%v/v）浸泡過夜。

----終止液含有硫酸，避免接觸皮膚。

----每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

----每步加樣時間應控制在5min內。

----孵育過程中應避光。

----不要使用過期試劑盒。

        ----不要交叉使用不同批號的試劑盒中的試劑。

6 儲存條件

        ----保存試劑盒于2~8℃。不要冷凍.

        ----顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

        ----將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2~8℃保存。

7 試劑變質的標志

        ----標準1的吸光度值小于0.5個單位（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。

8 樣品處理

----樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存。

----取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化鈉及25mL70%甲醇-水溶液。

----強力振蕩3分鐘。

----用快速定性濾紙過濾。

----取1mL濾液，加水4mL進行稀釋。

----取50μL稀釋液進行分析。

----*根據需要可以增減樣品量，但甲醇-水溶液的量也應相應增減。

9 酶免疫分析程序

----濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。

----取所需數量的板條插入微孔架，用洗液洗滌微孔板3min×2次。

----加入50mL標準品或處理好的樣品到微孔，記錄樣品及標準的位置，每個標準和樣品必須使用新的吸頭。

----加入50mL抗體溶液到每個微孔（注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入酶標物100mL，37℃孵育60min。

    ----用洗液洗滌微孔板3min×5次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入顯色液100mL（2滴），37℃孵育10~12min。

    ----每孔加入終止液50mL（1滴），立即用酶標儀在波長450nm處測定吸光度值（OD值）。

注：在定量分析中，顯色液和終止液需要用移液器準確量取。

10 樣品濃度計算

以標準溶液OD值與標準1OD值的比值為縱坐標，所對應標準溶液濃度（ng/mL）的對數值為橫坐標，制作標準曲線。根據樣品OD值與標準1OD的比值，可從曲線上得到對應點的橫坐標，即為AFB1濃度的對數值，求得反對數即為測定液中AFB1濃度C（ng/mL），按下列公式計算出樣品中AFB1含量：

AFB1含量（mg/kg）= C×K

式中：C：稀釋后樣品提取液中AFB1含量（ng/mL）

            K：樣品稀釋倍數（按照本說明書中樣品處理程序方法為25）

11試劑盒主要技術指標及參數

測試盒zui低檢出濃度0.1ng/mL，回收率70%~120%，與AFB2的交叉反應系數小于1%，與AFG1的交叉反應系數為4.65%，與AFG2交叉反應系數小于1%。試劑盒校正曲線的線性范圍0.1~1.0ng/mL，試劑盒條內變異＜10%，條間變異＜15%。