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Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品描述

《Quick Cell發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒》通過(guò)檢測(cè)支原體的特異性酶活性以達(dá)到檢測(cè)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是否被支原體污染的目的。在支原體裂解后，該支原體特異性的酶，在底物存在下，具有將ADP轉(zhuǎn)化成ATP的功能。由于熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的反應(yīng)需要ATP的參與，支原體特異性酶催化產(chǎn)生的ATP含量，可以通過(guò)該反應(yīng)轉(zhuǎn)化成生物發(fā)光（Bioluminescence）信號(hào)，該信號(hào)可以使用專門的發(fā)光檢測(cè)儀（Luminometer）或具有發(fā)光檢測(cè)功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)光的強(qiáng)度與ATP的含量成正比。通過(guò)比較細(xì)胞培養(yǎng)上清和未用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液上清二者的支原體特異性酶的含量，即可知道培養(yǎng)的細(xì)胞是否被支原體污染。反應(yīng)原理如下：

使用方法

1、檢測(cè)試劑的準(zhǔn)備

產(chǎn)品從-80 ℃冰箱取出，在冰上操作，*次使用，分別用2.5 mL支原體檢測(cè)溶液溶解試劑A和試劑B, 按每管50 μL可分別分裝到50個(gè)1.5 mL離心管中，根據(jù)待檢測(cè)的樣品數(shù)量及陰性對(duì)照數(shù)量確定A,B試劑的用量（不用的試劑放置于-80 ℃冰箱低溫保存，隨用隨取）。試劑A和試劑B，放室溫5分鐘左右（注意：不能加熱），等其熔解后放冰上待用。

? 注意：試劑A和試劑B只能在每次檢測(cè)之前從-80 ℃冰箱取出的，熔解后在室溫放置的時(shí)間盡可能的短，不能超過(guò)20分鐘。熔解后，放冰上的時(shí)間也不能超2小時(shí)。已經(jīng)融化后的試劑A和試劑B不能再次凍存使用。

2、陰性對(duì)照的設(shè)置

本試劑盒每次檢測(cè)都必須設(shè)置陰性對(duì)照。陰性對(duì)照除了沒有培養(yǎng)細(xì)胞外其他成分*相同，包括其中的血清批次、含量，抗生素等含量也必須*相同。陰性對(duì)照配制完后放于4℃冰箱。

3、待測(cè)樣品的準(zhǔn)備

為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染，。具體操作如下（請(qǐng)嚴(yán)格按照相應(yīng)的體積進(jìn)行操作）：

（1）貼壁細(xì)胞待測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)3天且匯合度在70-90%左右時(shí)，取180 μL培養(yǎng)液上清上，在普通臺(tái)式離心機(jī)上200 g (大約1500 rpm )低速離心5 分鐘，準(zhǔn)確吸取離心后的上清120 μL到一個(gè)新的1.5 mL離心管內(nèi)，丟棄含細(xì)胞沉淀的原有離心管。

懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞需要在換液傳代后，至少讓細(xì)胞生長(zhǎng)3天再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。

注意：離心力要嚴(yán)格控制在200 g左右，該離心力下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被沉淀下來(lái)而支原體不會(huì)。更高的離心力將可能導(dǎo)致支原體也被離心下來(lái)，從而導(dǎo)致假陰性。而更低的離心力將可能導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞不能被離心沉淀下來(lái)，從而導(dǎo)致支原體經(jīng)測(cè)時(shí)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的ATP也被釋放到溶液中，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。

（2）將含有120 μL上清的1.5 mL離心管，在臺(tái)式離心機(jī)上16000 g (大約13000 rpm)高速離心3 分鐘，棄去上清（約108 μL）注意：切勿讓吸頭碰到離心管底部，底部為可能含有支原體的沉淀。往離心管內(nèi)，加入108 μ*期配好的陰性對(duì)照培養(yǎng)液，并上下吹吸10次，將可能含有支原體的沉淀吹打均勻。該樣品用于后續(xù)的支原體檢測(cè)。

注意：將培養(yǎng)液替換成陰性對(duì)照的培養(yǎng)液是為了排除一些細(xì)胞代謝產(chǎn)物對(duì)后續(xù)檢測(cè)的可能干擾。

5、將熔解后的試劑A、試劑B、陰性對(duì)照和待測(cè)樣品放在室溫10分鐘左右（注意：不能加熱），以便其溫度與室溫相同，本試劑盒的*反應(yīng)溫度為18-30℃，必須確保室溫不低于15℃。

注意：制備好的待測(cè)樣品如果不是當(dāng)天立即檢測(cè)，放于-80℃冰箱保存，不得放于室溫、4 ℃或-20 ℃冰箱，樣品在-80℃可以保存一年左右；為了日后檢測(cè)方便，應(yīng)該同時(shí)凍存一些作為陰性對(duì)照的培養(yǎng)液。

6、吸取50 μL陰性對(duì)照和待測(cè)樣品，分別放入不透明（白色或者黑色均可）的96孔板內(nèi)，加入50 μL試劑A，室溫反應(yīng)15分鐘。

7、加入50 μL試劑B，室溫反應(yīng)3分鐘后，在多功能酶標(biāo)儀或者發(fā)光檢測(cè)儀（Luminometer）上，以儀器默認(rèn)的參數(shù)進(jìn)行發(fā)光值的檢測(cè)，5分鐘內(nèi)，連續(xù)測(cè)5次陰性對(duì)照和待測(cè)樣品的發(fā)光值，計(jì)算各自的平均值。

8、結(jié)果判斷

計(jì)算待測(cè)樣品的發(fā)光平均值與陰性對(duì)照的發(fā)光平均值的比值：

 ①如果比值>1.2，說(shuō)明待測(cè)樣品有支原體污染（陽(yáng)性）。嚴(yán)重的污染該比值可以達(dá)到10以上。

 ②如果比值在1.1-1.2之間，說(shuō)明待測(cè)樣品可疑有支原體污染（可疑陽(yáng)性）。該樣品需要繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)后，重新檢測(cè)。如果繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)后，重新檢測(cè)的比值仍然在1.1-1.2之間，應(yīng)該判為陰性。

 ③如果比值<1.1，說(shuō)明待測(cè)樣品無(wú)支原體污染（陰性）。

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