鬼筆環(huán)肽是一種雙環(huán)七肽毒素，它能選擇性的與動(dòng)植物體內(nèi)的纖維狀的肌動(dòng)蛋白 (F-actin) 結(jié)合，這種特殊的選擇性使之成為研究細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白微絲 (F-actin) 的有力工具。在光學(xué)顯微鏡下, 熒光標(biāo)記過的鬼筆環(huán)肽 (phalloidin-dye conjugate) 可以清晰地顯示出細(xì)胞內(nèi)微絲的形態(tài)和分布，廣泛被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的研究當(dāng)中。
鬼筆環(huán)肽染色原理
熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽在納克水平就可與F-actin選擇性的結(jié)合并且易溶于水，為檢測(cè)組織切片，培養(yǎng)細(xì)胞和無細(xì)胞體系中的actin的定位和定量提供了非常方便的標(biāo)記方法。通過其熒光特性，在特定波長(zhǎng)光的激發(fā)下發(fā)出熒光，使得細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)和分布清晰可見。
鬼筆環(huán)肽使用方法
以Alexa Fluor 488 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（綠色）為例
第1：準(zhǔn)備1× Alexa Fluor 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液吸取1 μL 1000×Alexa Fluor 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽存儲(chǔ)液到1 mL 含有1% BSA的PBS緩沖液中即可得到1×工作液。
第2：細(xì)胞染色步驟
(1) 細(xì)胞培養(yǎng)過夜或更長(zhǎng)，使其密度達(dá)到50~60% 匯合度。
(2) 吸掉培養(yǎng)液，37℃ 預(yù)熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。
(3) 使用含有3-4% 甲醛的PBS溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定10~30 min。
(4) 室溫條件下，用PBS清洗固定好的細(xì)胞2~3次，每次10 min。
(5) （可選）：室溫條件下，用溶于PBS的0.1% Triton X-100溶液透化處理3~5 min，從而增加其通透性。
(6) 室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10 min。
(7) 每孔加入 Alexa Fluor 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液100 μL /孔（96孔板），室溫避光染色20~90 min，夏季時(shí)間相對(duì)短些。
(8) 用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5 min，去除掉多余的Alexa Fluor 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽。
(9) （可選）：加入足量的即用型DAPI溶液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，如：100 μL /孔（96孔板），室溫3~5 min。用PBS清洗細(xì)胞2次，每次5 min。
(10) 于熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇Alexa FluorTM 488激發(fā)/發(fā)射濾片和/或DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。
鬼筆環(huán)肽注意事項(xiàng)
? 儲(chǔ)存條件：鬼筆環(huán)肽及其熒光標(biāo)記衍生物應(yīng)儲(chǔ)存在-20℃以下，保持干燥并避光。
? 細(xì)胞處理：在進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色前，細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)墓潭ê蜐B透處理，以確保染色效果。
? 熒光顯微鏡設(shè)置：根據(jù)所使用的熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，調(diào)整熒光顯微鏡的設(shè)置以獲得最佳的觀察效果。
? 不同的細(xì)胞染色情況不同，相應(yīng)Alexa Fluor鬼筆環(huán)肽使用量也需根據(jù)不同情況而定。
? 毒性較大，需帶上手套操作
? 避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。
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