• 使用人類多能誘導干細胞來源的肝細胞形成肝細胞球

• 對體外篩選的3D模型進行肝毒性評價

• 3D圖像分析過程中對目標樣品進行識別和分割，以達到*分割效果

背景介紹：

在發育生物學和組織生物學中，3D細胞球建模方式能夠加快轉化研究進程，因此越來越受到人們的重視。如何對3D樣本進行更高通量的定量分析成為了熱門研究課題。

在本實例中，MD公司建立并優化了一種分析方法，能夠對人類多能誘導干細胞來源的3D肝細胞球進行共聚焦成像和毒性評估（圖1）。

使用免洗染色法進行肝毒性評價：

1. 用肝毒性測試化合物處理細胞球72小時

2. 用溶解于無菌PBS中的三種熒光染料對細胞球進行染色。三種染料的濃度分別為：

• 2 μM calcein AM

• 3 μM EthD-1

• 10μM Hoechst 33342 (Life Technologies)

此外，為了評價化合物對凋亡信號的激活和對線粒體形態的影響，所用的染料濃度分別為：

• 7.5 μM CellEvent Caspase 3/7

• 200 nM MitoTracker Orange (Life Technologies)

肝細胞球的形成：

本實例使用的細胞為：

• 人類多能誘導干細胞來源的肝細胞 iCell Hepatocytes 2.0 (Cellular Dynamics International)

• HepG2細胞 (ATCC)

操作流程

1. 按照標準操作流程將凍存細胞復蘇；

2. iCell Hepatocytes 2.0 鋪板進行2D培養；

3. 貼壁細胞用Accutase酶消化后與Geltrex 基質(ThermoFisher Scientific)混合，細胞混合液以1000 cells/well的密度種植在低吸附成球孔板中(InSphero or Corning)；

4. 將孔板以300 g轉速離心2分鐘使細胞沉淀并去掉基質中的氣泡，然后將孔板放入細胞培養箱，在37°C, 5% CO2條件下進行培養。培養HepG2 細胞無需加入基質；

5. 培養24–48小時后細胞球形成。

將染料加入細胞球培養體系中孵育2小時，然后采集圖像。染料無需洗脫，加樣過程小心謹慎，避免損傷細胞球進而造成細胞球解體或偏離原位。典型的細胞球染色結果如圖 2所示。

高通量3D圖像的采集和分析過程：

采用ImageXpress® Micro 共聚焦高內涵成像系統(Molecular Devices)采集圖片，具體設置如下：

• 物鏡種類--10倍鏡和20倍鏡

• 層掃間距--5-10μm

• 層掃范圍--100-120μm

• 層掃起始位置--多孔板孔底

所有的結果中都包含有2D maximum投射圖像，分析過程中可以對這些圖像進行保存和調用。

識別并分析3D樣品

使用MetaXpress® 高內涵圖像采集分析軟件對3D圖像進行分析。CME用戶模塊編輯器中新增了3D分析模塊(圖3) ，該模塊能夠對3D結構的體積、熒光強度、距離等參數進行量化并對圖像進行批量分析。其中 “Find Spherical Objects”功能可以對目標結構的形態學參數（zui小和目前較大寬度，zui小和目前較大Z軸層數）和目標結構與背景之間熒光強度的差值進行自定義設置，對不同大小的目標結構（小到細胞器，大到多細胞團）進行定義。比如將形態參數設定為：

• 細胞核寬度范圍--5-15 μm

• 細胞核層數--1-2層

• 細胞核與背景的熒光強度差--200 熒光單位

• 肝細胞球寬度范圍--100-300 μm

• 肝細胞球層數--5-7層

• 肝細胞球與背景的熒光強度差-- 400 熒光單位

分析結果包括每個目標結構的球體體積、直徑（或平均體積、平均直徑），以及特定熒光通道中球體的總熒光強度和平均熒光強度等參數。

“Find Spherical Objects”功能還可用于識別單個細胞和細胞核或利用適當的特征將不同的單細胞區別開來。此外，3D分析模塊可以按照用戶自定義選項“Connect by BestMatch”, “Connect byTouching”, 和 “Do NotConnect Objects”將不同層面的目標結構連接起來。

首先對Z軸層掃中的每層圖片按照2D圖片進行分割、分析并得到細胞核個數，細胞死/活和細胞分類等參數的測量值；其次利用用戶定義的目標結構的目前較大范圍將其連接起來。如：

• 細胞核目前較大范圍 3-6 μm

• 細胞質目前較大范圍 20-30 μm

zui終，在3D結構中將細胞核或單細胞分割出來。整個過程中目標結構不會丟失也不會被重復計數。所有的細胞（如：calceinAM 陽性/陰性細胞；Ethidium homodimer陽性/陰性細胞）都會被識別、被計數。

為了直觀表現目標結構的整體/平均熒光強度、體積、直徑、間距以及目標結構在三維空間中的定位等參數，可用不同顏色標記單個細胞。利用細胞球標記范圍（ spheroid masking ）對更小的結構進行計數，這些結構可能在標記范圍（mask）之中或在標記范圍（mask）之外。如：對每孔只含有一個細胞球的樣品進行分析時，利用單細胞標記（ single-cell masking ）可以對所有細胞進行計數并將位于細胞球中和細胞球外的細胞區別開來。當細胞球不完整時，這種圖形處理方式就顯得十分重要。對每孔含有多個細胞球的樣品（細胞球與基質共培養）進行分析時，這種圖形處理方式可以定義每個細胞球的容量并得出均值。

圖 4A 顯示了不同層面的2D圖像中 calceinAM 陽性細胞的細胞分類結果。利用“Connect by Best Match” 功能可以將細胞在3D空間中連接起來。相同的方法可以分析 ethidium homodimer 陽性/陰性細胞(細胞死/活分析) 也可以分析線粒體、熒光強度、細胞凋亡還可以分析特定染料和標記物。

使用多參數表型篩選結果進行毒性評價

利用多種肝毒素處理細胞球，觀察細胞球表型和細胞含量的顯著變化。許多細胞球失去了球狀結構，球體發生崩解，細胞球變得松散、扁平、不規則。細胞從主體結構中脫離，或出現凝結核，表明細胞已經死亡。 當化合物濃度超過一定范圍，細胞表型就會出現上述變化 (圖4B)。 利用圖像量化分析得到的參數對細胞球的形態特征、細胞含量和結構復雜程度進行評估。檢測細胞球體積、直徑、熒光強度，同時檢測calcein AM 陽性細胞(活細胞)、EthD-1 陽性細胞（死細胞）個數。細胞球經化合物處理后，細胞總數沒有變化，死細胞數量上升，活細胞數量下降（具有濃度依賴特性）；細胞球和單個細胞（細胞質）中calcein AM的平均熒光強度顯著降低。

為進一步研究細胞毒性機制，我們對細胞的凋亡特征和線粒體完整性進行評估?；衔锾幚砑毎?4小時后用caspase 3/7 熒光染料檢測細胞凋亡的活化程度。 caspase 3/7 對細胞球（經甲基汞處理的對照組細胞球）的染色結果如圖2B所示。用化合物處理細胞球后會誘導細胞凋亡，導致 caspase 3/7 熒光強度增加，caspase 3/7 陽性細胞（凋亡細胞）的個數增加。 用MitoTracker Orange 熒光染料染色結果來反映線粒體膜電位的變化情況。用化合物處理細胞球后會破壞線粒體結構的完整，進而導致MitoTracker Orange熒光強度降低（具有濃度依賴特性，圖2C ）

對活細胞個數、 calcein AM 熒光強度、 calceinAM 陽性細胞含量等參數進行測量后發現這些參數都的符合四參數劑量反應曲線模型(圖 4B)。IC50 值 (表 2) 由SoftMax® Pro 6 軟件(MolecularDevices)生成。

總結：

在對肝毒性進行評價的過程中，3D肝臟球模型+高內涵3D分析模式作為一種反應靈敏、可重復性高的方法，越來越展現出廣闊的應用前景。該方法預測準確率相比于動物實驗和臨床數據仍需要繼續完善。相關模型的進一步發展，檢測方法的進一步優化有利于拓展該方法在體外篩選領域中的應用空間。

參考文獻：

1. Chang, T. T., & Hughes-Fulford, M. (2009).Monolayer and Spheroid Culture of Human Liver Hepatocellular Carcinoma Cell Line Cells Demonstrate Distinct Global Gene Expression Patterns and Functional Phenotypes. Tissue Engineering Part A, 15(3), 559-567.

2. Hartung, T. (2009). Toxicology for the twentyfirst century. Nature, 460(7252), 208-212.

3. Kunz-Schughart, L. A. (2004). The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening:The Multicellular Spheroid Model. Journal of Biomolecular Screening, 9(4), 273-285.

4. Lu, J., Einhorn, S., Venkatarangan, L., Miller, M., Mann, D. A., Watkins, P. B., & Lecluyse,E. (2015). Morphological and Functional Characterization and Assessment of iPSCDerived Hepatocytes for In Vitro Toxicity Testing. Toxicological Sciences, 147(1), 39-54.