基于細胞涂色檢驗的表型分析的簡化工作流程

Angeline Lim, Misha Bashkurov | Molecular Devices LLC

David Egan, Victor Wong | Core Life Analytics

簡介

細胞涂色檢驗（cell painting assay）等多參數高內涵篩選方法越來越多的被應用到從藥物研發到功能基因組學篩選等領域。細胞涂色檢驗用到多達6種熒光染料在單細胞水平來標記及觀察各種細胞器。分析中獲得的所有特點都能賦予指定的細胞的細胞表征。另外，通過對比新型化合物和參比化合物的表型特征能了解到作用機制。大多數生物學家都熟悉細胞涂色檢驗所用的方法。然而，要想在海量的實驗數據中獲得有意義的信息還需要計算工具的輔助。

在此，我們介紹了一種易于完成的細胞涂色檢驗的完整流程。通過這一方法，我們發現用同一種化合物處理的細胞表現出相同的表性特征。分層聚類分析能將紫杉醇和魚藤酮之類的高毒性化合物分到同一組。氯喹和粉防己堿這兩種影響自噬的化合物同樣被分到同一組里。這些結果表明此處提出的工作流程是開展高內涵表型分析可行且可靠的方法。

方法

基于圖像的分析工作流程概述。以下列出了每個步驟的詳細信息。

1、U2OS細胞（ATCC）按每孔2000個細胞接種。

2、總共測試了11中化合物，每種化合物按照1:3梯度稀釋（共7個濃度），每個濃度4個復孔，同時加入合適的對照。化合物如下：Ca-074-Me，羰基氰化物間氯苯腙（CCCP），氯喹（chloroquine），細胞松弛素D（cytochalasin D），依托泊苷（etoposide），拉氏菌素B（latrunculin B），雷帕霉素（rapamycin），魚藤酮（rotenone），十字孢堿（staurosporine），紫杉醇（paclitaxel）和粉防己堿（tetrandrine）。

3、化合物處理24小時后，根據Bray等人的實驗方案用細胞涂色染料對細胞進行染色。包括以下染料：MitoTracker Deep Red，wheat-germ agglutinin/Alexa Fluor 555，Concanavalin A/Alexa Fluor 488，phalloidin/Alexa Fluor 568，SYTO14和Hoechst 33342。

4、用美谷分子儀器的ImageXpress®顯微共聚焦高內涵成像系統（ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System（Molecular Devices））進行圖像采集，物鏡為20× Plan Apo objective，激發/發射濾光片如下：DAPI 377/447，FITC 475/536，TRITC 543/593，Texas Red 560/624，Cy5 631/692。

5、用IN CartaTM圖像分析軟件進行圖像分析。選擇的280個測量值包括跟強度、紋理、形狀、空間關系及共定位評分相關的參數。

6、細胞級數據已上傳至StratoMineRTM進行進一步數據分析。簡言之就是實施了質量控制、微孔板正規化、數據轉換以及特征標準化。用主成分分析（principal component analysis，PCA）降低數據集的維度。進一步的下游分析，例如命中選擇及聚類分析，則基于主成分和推導的表型距離評分。

結果

血管生成建模

在我們的模型檢測中，U2OS細胞用11種化合物處理24小時，之后按照以前發表的實驗方案處理。用ImageXpress顯微共聚焦系統進行細胞成像（圖1）。

圖1. 細胞涂色檢驗。細胞經化合物處理，染色然后成像。對照孔各個采集通道的成像示例。最后一個圖片展示了肌動蛋白、內質網和細胞核的復合圖像。

特征提取

使用IN Carta軟件，可調整圖像分析程序以實現細胞及細胞器的可靠檢測（圖2）。深度學習語義分割模塊（SINAP）可以用來提升挑戰性特征的檢測。預訓練的深度學習模型可用來檢測細胞核或細胞。或者，用戶也可以根據自己感興趣的特定對象來訓練新的模型。

圖2. IN Carta軟件中的特征提取。A）在IN Carta軟件中建立分析實驗方案來分割各個細胞結構。此處我們用內置的細胞核模型實現了所有處理的細胞核的有效分割。其他細胞特征包括細胞質區域、肌動蛋白絲網絡、內質網及線粒體也得到了分割。在設定分析時選擇了跟強度、紋理、共定位和形狀相關的測量值。在實驗方案中我們共選擇了細胞及亞細胞結構的280個測量值。B）IN Carta軟件中帶有特征掩飾疊加的圖像示例。

數據分析工作流程

將IN Carta軟件中獲得的測量值上傳至HC StratoMineR進行進一步數據分析（圖3）。

圖3A-B. 利用HC StratoMineR進行數據分析。A）HC StratoMineR是一個基于網絡的平臺，能通過典型的工作流程指導用戶進行高內涵多參數數據分析。B）QC步驟的散點圖。X軸代表了所有樣本，Y軸代表了選中的特征（細胞核區域）。

圖3C-D. 利用HC StratoMineR進行數據分析。C）主成分分析（廣義加權最小二乘法）將數據減低至15個成分。對PCA4的特征貢獻以極坐標圖顯示。D）3D散點圖顯示了數據點與3種不同PCA之間的互作。

表型特征比較-聚類

距離分數根據選定的主成分分數進行計算。這一分數代表了樣本與陰性對照之間的表型距離，能用于篩選分析中的命中選擇。隨后，可基于選中的特征或成分進行分層聚類分析。

用同一種化合物處理的細胞聚類到一起（圖4A，簇9,10）。已知具有相似細胞效應的化合物也聚類到一起。肌動蛋白聚合抑制劑細胞松弛素D和拉氏菌素B共同存在于簇6中。在自噬信號通路中有作用的粉防己堿和氯喹也聚類到一起（圖4B）。

圖4. 聚類分析。A）樹狀圖代表了分層關系。屬于相同簇的孔（編號）用彩條表示。每個孔基于距離分數的p值展示了出來。注意，簇9僅由十字孢堿處理的細胞組成，而簇10僅由依托泊苷處理的細胞組成。B）屬于某些簇的化合物處理的細胞示例。簇5由粉防己堿和氯喹處理的細胞組成。兩者處理的孔中內質網點都有增加。簇4由魚藤酮和紫杉醇處理的細胞組成，這些孔中的部分細胞有起泡出現。表明了細胞毒性作用。

基于表型特征的劑量-反應建模

圖5. 劑量-反應曲線。使用從命中選擇步驟獲得的表型距離分數繪制IC StratoMineR中每一種化合物劑量反應曲線。Y軸代表了表型距離，X軸代表濃度。

結論

我們的結果表明利用ImageXpress顯微共聚焦系統、IN Carta軟件和StratoMineR實現基于圖像的分析的可行性。

IN Carta軟件結合了易用性及更高級的特征分割選項（SINAP），可實現細胞特征的可靠分割。

StratoMineR平臺允許非專家用戶根據直觀的引導式工作流程進行快速的表型數據分析。

參考文獻

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