簡介

為了更好地模擬體內微環(huán)境并且預測化合物的功效和毒性，細胞模型變得愈加復雜。人們對使用三維 （3D） 細胞球進行組織生物學建模和毒性評估越來越感興趣。使用 3D 培養(yǎng)物開發(fā)通量更高的定量檢測是一個活躍的研究領域。在本研究中，我們開發(fā)了用人誘導多能干細胞 （iPSC）形成 3D 細胞球的方法。使用高內涵成像 （HCI） 和快速動力學熒光成像 （FLIPR），我們用鈣敏感染料監(jiān)測細胞內鈣水平的變化，測量了各種化合物對心臟細胞球搏動率和模式的影響。

心臟細胞球的形成

使用了來自 Cellular Dynamics International （CDI） 的冷凍保存的iCell心肌細胞進行此研究。將細胞解凍并鋪板至超低吸附的（ULA） U 形底 96 孔板（20，000 個細胞/孔）和384 孔板（Corning）中（10，000 個細胞/孔），并在維持培養(yǎng)基中孵育 4 天以形成細胞球培養(yǎng)物。心臟細胞球在 48 小時內由 iPSC 源性心肌細胞有效形成，并在培養(yǎng) 3-4 天后自發(fā)收縮。然后，這些 3D 細胞模型可用 Ca2+ 敏感染料染色以評估心臟毒性。細胞內 Ca2+ 流引起的熒光強度變化被用作細胞球收縮的替代標記。在對心臟活性和心臟毒性化合物的刺激下，觀察到基線搏動模式的顯著改變。

我們在這里描述了兩種記錄、定量和表征 iPSC 源性心臟細胞球搏動模式的方法：使用高內涵成像（ImageXpress® Micro 高內涵成像系統(tǒng)）和快速動力學熒光成像（FLIPR Tetra® 高通量細胞篩選系統(tǒng)）。

優(yōu)勢

使用高內涵成像采集延時圖像并分析心臟細胞球搏動模式

使用 FLIPR Tetra system 對所有孔中的鈣流進行同步動力學
讀取測量不同化合物對心臟細胞球活性的影響

圖 1：檢測工作流程示意圖。將 iCell 心肌細胞2 解凍并鋪板至 U 形底部低附著板中以形成 3D 心臟細胞球。培養(yǎng) 4 天后，用化合物處理細胞球所需的時長，用 FLIPR 鈣 6 染料染色，并使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)采集延時圖像。

使用高內涵成像隨時間推移采集和分析心臟細胞球
成像方法可精確檢測和可視化心臟細胞球，并包括在所需的時間周期和頻率內采集延時圖像。
本研究中使用的檢測工作流程如圖 1 所示。ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)使用自動延時采集獲得細胞球圖像。記錄了整個細胞球的鈣流模式，發(fā)現(xiàn)其與收縮同步（圖 2）。記錄頻率設置為 10-20 次讀取/秒，每孔 5-10 秒（或更長）的讀取時間，使用 FITC 激發(fā)和發(fā)射濾光片，放大倍數(shù)為 20 倍或 10 倍。將細胞保存在環(huán)境控制下（37 °C，5% CO2）或密封。為實現(xiàn)更高的讀數(shù)頻率，激發(fā)時間為 10 ms 或更短。該成像方法對任何細胞球尺寸都有效。我們測試了從每孔 3，000-20，000 個平板細胞制備的細胞球。我們證明，跳動頻率不依賴于細胞球大小（數(shù)據(jù)未顯示）。使用標準推薦操作規(guī)程，使用 Hoechst 細胞核染色和 FLIPR®鈣 6 染料 （Molecular Devices， LLC） 對細胞進行染色。

圖 2. 加載 Ca2+ 敏感染料的iPSC 源性心肌細胞球收縮的延時圖像系列。 每個圖像均以 100 毫秒的間隔拍攝。黃色/紅色（偽彩）表示高 Ca2+ 濃度和收縮狀態(tài)。

圖 3. 化合物處理的心臟細胞球的動態(tài)熒光強度。將圖像數(shù)據(jù)導入 SoftMaxPro 7 軟件，用于分析跳動率、振幅、峰寬和其他讀數(shù)。此處顯示的是延時強度圖的板視圖。

使用 MetaXpress Journal（可應要求提供）分析圖像。Journal會自動查找細胞球，確定每個時間點的平均熒光強度，并以板格式保存每個時間點的強度數(shù)據(jù)。通過保存細胞球圖像的延時堆棧，視頻剪輯可保存在成像軟件中。通過在Display模式下顯示強度與時間的關系，可以查看跳動模式。每次延時拍攝的強度數(shù)據(jù)也可以導出為 Excel 格式。可使用SoftMax Pro 7 軟件（圖 3）對跳動模式進行進一步分析，軟件可導入強度數(shù)據(jù)、分析跳動模式并定義主要參數(shù)，包括通量、跳動振幅、峰寬或衰減時間的變化1，2。使用幾種測試化合物觀察到的
鈣流頻率的濃度依賴性曲線如圖 4 所示。表 1 顯示了使用鈣流頻率作為讀數(shù)，計算的選定化合物的 IC 值。

圖 4. 由選定化合物引起的搏動頻率的劑量依賴性變化圖。

表 1 根據(jù)鈣流頻率的濃度依賴性變化計算的選定化合物的 IC50 值。

使用高內涵成像評估細胞球活性
這種高內涵成像方法也可用于定義不同化合物對細胞活性的影響。例如，我們證明，在化合物處理后，可通過性染料組合染色來評估心臟細胞球的
細胞活力：鈣黃素 AM（取決于酯酶活性的活細胞染色）、Ethidium 同型二聚體（細胞不可滲透的死細胞指示劑）和 Hoechst（標記所有細胞的細胞滲透性核染色，包括活細胞和死細胞群），可在即用型 EarlyTox 活細胞/死細胞檢測試劑盒中獲得。
用染料孵育兩小時后，使用 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)對染色的細胞球進行成像。
使用 10x 或 20x 放大倍率拍攝 Z 層圖像，間隔 10 μm，范圍約為 150 μm。
使用 MetaXpress 軟件使用 2D 和 3D 分析模塊分析細胞球內總活細胞和死細胞的圖像。先前描述了用于分析細胞球以檢測活性標記物的方法3。圖 5 顯示了對照和地高辛處理的細胞球的示例分析。可使用以下測量值進行化合物效應的多參數(shù)
評估：細胞數(shù)量、細胞球大小和細胞活性。

圖 5. 使用 iPSC 源性心臟細胞球進行心臟毒性成像。（上圖）對照和地高辛處理的細胞球用活性標記物染色：Calcein A（綠色）、Hoechst（藍色）和EthD-1（紅色）。（下圖）圖像分析mask顯示藍色細胞球、粉色活細胞的細胞質和黃色死細胞。

使用 FLIPR Tetra 系統(tǒng)監(jiān)測搏動心肌細胞球中的 鈣流，從而優(yōu)化高通量篩選

相比，FLIPR Tetra 系統(tǒng)與一次僅對一個孔進行延時成像的高內涵成像方法相比，FLIPR Tetra系統(tǒng)可以同時讀取整塊板的熒光強度，因此可以對所有孔進行鈣流的同步動力學讀取。該系統(tǒng)還可以兼容自動化液體和平板處理。
ScreenWorks Peak Pro 軟件模塊可用于分析和表征跳動曲線，從而產(chǎn)生跳動速率、峰值頻率和寬度或不規(guī)律波形等多參數(shù)輸出。

圖 6. 對測試化合物的心臟細胞球反應進行快速動力學熒光分析。

（A）比較經(jīng)選定化合物處理并使用 FLIPR Tetra 儀器測量的心臟細胞球的 鈣流曲線。頻率、振幅、峰寬和其他參數(shù)ScreenWorks PeakPro 軟件模塊自動計算。（B） 測試化合物對心臟細胞球搏動率影響的劑量-反應圖。

iPSC 源性心臟細胞球的鈣流檢測，使用 FLIPR Tetra系統(tǒng)的 96 孔或 384 孔板中進行了高通量篩選 （HTS）優(yōu)化。如前所述，在低附著 U 底板中形成心臟細胞球。我們觀察到，如果細胞球尺寸相對較大（300-500 μm，由 10，000-20，000 個鋪板細胞形成），FLIPR Tetra 系統(tǒng)可更有效地檢測細胞球。使用 FLIPR 鈣 6 染料監(jiān)測與細胞搏動同步的 鈣流的變化。將試劑（2X 濃度）添加到板中，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 2 小時。將細胞球暴露于化合物中 2 小時或 24 小時。使用 FLIPR Tetra系統(tǒng)以每秒約 8 幀的速度采集藥物前讀數(shù)，其中激發(fā)波長為 485 nm，發(fā)射波長為 530 nm。在不同化合物孵育時間后采集額外的讀數(shù)，以了解不同化合物暴露時間之間的關系。鈣流的記錄通常持續(xù)約 2 分鐘，以獲得可靠的數(shù)據(jù)集。

為了說明 FLIPR Tetra 快速動力學熒光成像在測定3D 細胞模型方面的適用性，我們將心臟細胞球置于幾種已知的心臟活性和心臟毒性化合物中，包括 α和 β-受體阻滯劑（異丙腎上腺素、普萘洛爾和維拉帕米）、已知影響 hERG 通道的化合物（鹵吡多）和離子通道阻滯劑（利多卡因）。此外，還測試了幾種環(huán)境毒素，包括殺蟲劑（羅滕酮）、阻燃劑（磷酸三苯酯）和其他毒性化學物質。

治療以劑量依賴性方式顯著改變了跳動模式。對照和測試化合物處理的心臟細胞球的鈣流（搏動）模式如圖 6A 所示。毫不奇怪，化合物處理極大地改變了劑量依賴性分子的跳動模式（圖 6B）。然而，將 3D 細胞球培養(yǎng)物測定的 IC50值與以傳統(tǒng) 2D 形式鋪板的細胞獲得的細胞顯示出測定靈敏度的顯著差異，其中 3D 培養(yǎng)物在反應方面顯示出一般的右移趨勢（即 IC 值更高）（表 2）。與傳統(tǒng)的 2D 培養(yǎng)形式相比，降低對這些測試化合物的心臟細胞球敏感性是否更具預測性，將需要額外的跟進。盡管如此，這些結果表明，將小型 iPSC 源性心臟 3D 細胞模型與快速動力學熒光成像相結合，以支持高通量心臟毒性篩選的潛在效用。

表 2. 根據(jù)兩種不同形式的經(jīng)測試化合物處理的 iPSC 源性心肌細胞計算的鈣流 IC 值比較：3D 細胞球與傳統(tǒng) 2D 培養(yǎng)。

參考文獻

1.       Sirenko， O.， C. Crittenden， N. Callamaras， J. Hesley， Y.-W. Chen、C. Funes、I. Rusyn、B. Anson 和 E. F. Cromwell。“使用 IPSC 細胞對化合物對心肌細胞生理學的影響進行多參數(shù)體外評估。” 生物分子篩選雜志 18.1（2012 年）：39-53. 網(wǎng)絡。

2.       Sirenko、Oksana、Evan F. Cromwell、Carole Crittenden、Jessica A. Wignall、Fred A. Wright 和 Ivan Rusyn。“評估人誘導多能干細胞中的搏動參數(shù)可實現(xiàn)體外心臟毒性定量篩選。” 毒理學和應用藥理學 273.3（2013 年）：500-07. 網(wǎng)絡。

3.       Sirenko、Oksana、Michael K. Hancock、Jayne Hesley、Dihui Hong、Avrum Cohen、Jason Gentry、Coby B. Carlson 和 David A. Mann。“使用共聚焦成像和三維圖像分析對 IPSC 對肝臟細胞球的毒性化合物效應進行表型表征。” 檢測和藥物開發(fā)技術 14.7（2016 年）：381-94. 網(wǎng)絡。