簡(jiǎn)介

對(duì)于監(jiān)測(cè)細(xì)胞數(shù)目、繁殖、健康、融合度和細(xì)胞毒性的多種生物學(xué)應(yīng)用，需要進(jìn)行無(wú)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)。這些應(yīng)用需要使用有效和可靠的透射光(TL)成像和分析功能，此功能可提供精確分割以定量細(xì)胞并評(píng)估各種細(xì)胞反應(yīng)和形態(tài)。此外，高對(duì)比度透射光成像與熒光標(biāo)記成像的結(jié)合對(duì)于許多基于細(xì)胞的檢測(cè)分析來(lái)說(shuō)是非常重要的。

MetaXpress 6.5自定義模塊編輯器中的TL 細(xì)胞分割算法是一種使用透射光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像及定量的優(yōu)化且可靠的分析算法。此應(yīng)用說(shuō)明展示了TL細(xì)胞分割的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。通過(guò)將透射光中的總細(xì)胞計(jì)數(shù)與熒光染色的細(xì)胞核計(jì)數(shù)進(jìn)行比較來(lái)分析和定量 CHO和HeLa細(xì)胞的算法（圖 1）。

方法

將CHO和HeLa細(xì)胞稀釋液接種到黑色、底部透明的96孔板中，從板頂行開(kāi)始布板（最頂行中每孔20，000個(gè)細(xì)胞）。將每種細(xì)胞按1：2的比例在微孔板中向下進(jìn)行稀釋，6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，在 37°C、5% CO2 的培養(yǎng)箱中用Hoechst 33342細(xì)胞核染料對(duì)細(xì)胞染色30分鐘。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用DPBS洗滌兩次。通過(guò)ImageXpress® Micro高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和MetaXpress軟件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。使用10x Plan Fluor物鏡對(duì)一個(gè)視野進(jìn)行成像，該物鏡可準(zhǔn)確捕獲多達(dá)1500個(gè)細(xì)胞。使用透射光和DAPI熒光通道拍攝圖像，曝光時(shí)間分別為15 ms和35 ms。

優(yōu)勢(shì)

使用
透射光成像對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分割和計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)透射光下的細(xì)胞增殖

使用多種分析方法評(píng)估TL細(xì)胞分割算法的效果

了解多種細(xì)胞類型和大小的量化工具
定量和分析工具

圖 1：設(shè)置用于分析透射光下拍攝的HeLa和CHO細(xì)胞圖像的自定義模塊。 使用Hoechst 33342細(xì)胞核染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。使用DAPI通道和透射光 (TL) 進(jìn)行細(xì)胞成像，設(shè)置自定義模塊以根據(jù)透射光成像和細(xì)胞核熒光成像分析和定量細(xì)胞。

在自定義模塊編輯器中設(shè)置TL細(xì)胞分割算法

精準(zhǔn)的細(xì)胞分割對(duì)于定量通過(guò)透射光捕獲的細(xì)胞而言非常重要。為TL細(xì)胞分割選擇的細(xì)胞算法A可以精確地分割和識(shí)別HeLa和CHO細(xì)胞 （圖 2）。還有其他設(shè)置可供選擇。細(xì)胞算法B或細(xì)胞算法C可分別用于分析小細(xì)胞或大細(xì)胞。在分析模塊中進(jìn)行設(shè)置可以過(guò)濾總面積小于150 pM2的細(xì)胞（圖 3）。這個(gè)設(shè)置可以確保避免將圍攏的小型死細(xì)胞當(dāng)做活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析。此外，經(jīng)過(guò)設(shè)置的細(xì)胞核計(jì)數(shù)算法可以準(zhǔn)確定量HeLa和CHO的細(xì)胞核（圖 4）。

結(jié)合透射光下的細(xì)胞計(jì)數(shù)與熒光胞核計(jì)數(shù)

使用TL細(xì)胞分割算法設(shè)置的自定義模塊可精確分割HeLa和CHO 細(xì)胞（圖 6）。透射光中的總細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞核計(jì)數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明TL細(xì)胞分割算法的準(zhǔn)確性（圖 7）。除細(xì)胞計(jì)數(shù)外，TL細(xì)胞分割算法還可生成多個(gè)數(shù)據(jù)以評(píng)估細(xì)胞反應(yīng)和細(xì)胞形態(tài)的不同特征（圖 5）。例如，可生成細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物的總計(jì)數(shù)和平均計(jì)數(shù)、面積、強(qiáng)度、形狀、高度、寬度以及各種其他不同的讀數(shù)。使用過(guò)濾器選項(xiàng)去除圍攏的死細(xì)胞可進(jìn)一步優(yōu)化此過(guò)程，并減少使用活細(xì)胞或全細(xì)胞染色的必要性。此外，細(xì)胞核染色和計(jì)數(shù)細(xì)胞核對(duì)象算法的使用展現(xiàn)了可通過(guò)分析透射光成像。

圖 2. 將TL細(xì)胞分割算法應(yīng)用于選定的HeLa細(xì)胞透射光圖像。在自定義模塊編輯器中，可以通過(guò)設(shè)置選擇源波長(zhǎng)和代表細(xì)胞類型對(duì)TL細(xì)胞分割算法進(jìn)行配置。細(xì)胞算法A可以有效地識(shí)別圖像中的HeLa和CHO細(xì)胞。

圖 3. TL細(xì)胞分割疊加和過(guò)濾器設(shè)置篩選后疊加的比較圖像。 將最小面積設(shè)置為150 μm2以過(guò)濾掉死細(xì)胞。

圖 4. 使用細(xì)胞核對(duì)象分割模塊對(duì)熒光細(xì)胞核圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞核對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量，使用Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。對(duì)超過(guò)局部背景參數(shù)的最小和最大寬度估值和強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化，以精準(zhǔn)識(shí)別所有細(xì)胞核。細(xì)胞核為藍(lán)色（左圖），分析遮蔽為黃色（右圖）。

圖 5. HeLa細(xì)胞的代表性圖像，設(shè)置自定義模塊圖像分析方法。 藍(lán)色遮蔽代表通過(guò)TL細(xì)胞分割算法使用TL過(guò)濾器遮蔽篩選發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，黃色代表通過(guò)計(jì)數(shù)核對(duì)象算法發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞核。自定義模塊的所需測(cè)定項(xiàng)可在測(cè)定選項(xiàng)卡中進(jìn)行設(shè)置。需要測(cè)定的對(duì)象被定義為可以通過(guò)TL細(xì)胞分割算法進(jìn)行遮蔽的對(duì)象，選擇計(jì)數(shù)核對(duì)象遮蔽測(cè)定每個(gè)目標(biāo)物的特性。

圖 6. HeLa和CHO細(xì)胞的圖像，以及應(yīng)用TL細(xì)胞分割自定義模塊優(yōu)化后的圖像分析結(jié)果。DAPI 細(xì)胞核以藍(lán)色顯示（左），在圖像分析中掩膜為黃色（右），透射光中的細(xì)胞以淺藍(lán)色掩膜。通過(guò)10x Plan Fluor物鏡在ImageXpress Micro系統(tǒng)上捕獲圖像，并使用新TL細(xì)胞分割算法配置的自定義模塊對(duì)圖像進(jìn)行分析。

圖 7. 基于TL細(xì)胞分割和核計(jì)數(shù)對(duì)象模塊比較HeLa和CHO細(xì)胞的總細(xì)胞計(jì)數(shù)。 按1：2的比例稀釋細(xì)胞，從每孔20，000個(gè)細(xì)胞的濃度開(kāi)始。

結(jié)論

MetaXpress自定義模塊編輯器中的TL細(xì)胞分割算法可以有效定量和分析多種細(xì)胞類型和大小。ImageXpress® Micro Confocal轉(zhuǎn)盤共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)支持的優(yōu)化分割功能可分析與熒光團(tuán)無(wú)關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)。使用透射光圖像定量細(xì)胞可以使研究人員的檢測(cè)能力更加靈活。此應(yīng)用說(shuō)明描述的方法展現(xiàn)了TL細(xì)胞分割算法可用于多種檢測(cè)，包括但不限于增殖、細(xì)胞毒性研究和轉(zhuǎn)染。