TOP-10
電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。TOP-10來源于MC1061菌株，是目前實驗室常用的感受態(tài)細(xì)胞之一，基因型與DH10B高度類似 (DH10B為galE15型，而 TOP-10為galU型)。
操作說明：
一、0.1cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面 0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
二、取-80℃保存的TOP-10電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5分鐘，待其融化，加入目的DNA (質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手bo打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。
A.測定轉(zhuǎn)化效率使用1μl 10pg/μl的對照質(zhì)粒pUC19；
B.對于連接產(chǎn)物，請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液(10mM TrisHCl，pH7.5；1mM EDTA)重懸，DNA濃度不超過100ng/μl，體積不超過5μl/50μl 感受態(tài)。
三、用200μl槍頭將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。
四、啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25μF，PC=200Ω，V=1.8kV(此為BioRad電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。
五、2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700μl不含抗生素的無菌S.O.C.培養(yǎng)基（室溫），用1ml槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50ml離心管（BD Falcon50ml錐形離心管等），向離心管中補(bǔ)加S.O.C.培養(yǎng)基至5ml。37℃，225rpm 復(fù)蘇60分鐘。
六、5000rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17小時。
3
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務(wù)