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流感病毒基因序列變異的NGS監測方法
流感病毒感染包括人類在內的許多鳥類和哺乳動物，并且由這些病毒引起的感染具有重大的公共衛生，動物衛生和經濟意義。甲型流感病毒（IAV）在遺傳和抗原上都極為多樣化，并廣泛分布于的野生禽類，家禽和哺乳動物以及人類中。有兩種主要的表面糖蛋白，血凝素和神經氨酸酶，具有多種亞型。在144種可能的HA-NA亞型組合中，至少有131種已在NCBI流感病毒數據庫中從禽類中分離出來的菌株中進行了確認。對流感的監測，快速診斷，傳播，發病機制和疫苗學的持續研究對于預防和減輕其影響至關重要。
流感研究的一個關鍵方面是檢測流感病毒的類型，亞型和基因型，并對其進行分類，特別是對于不同樣本（例如野生鳥類，家畜和人類患者）中新出現的病毒變異要進行監測，預防和治療。技術進步允許開發新的方法來鑒定來自各種樣品類型的流感病毒分離株，包括基于培養，抗體結合，血清學測定，基因擴增和基因測序方法。比較全面的檢測方法仍然是采用高通量測序技術。由于典型臨床樣品中病毒RNA的數量較低，所有這些研究都采用了病毒特異性引物和病毒特異性PCR擴增策略來捕獲目標流感序列。然而近在下一代測序（NGS）中越來越多地強調PCR引入的錯誤。目前已經顯示常用的PCR酶，包括高保真酶，均具有10-5至10-6點突變/ bp /重復的錯誤率。除了特征明確的聚合酶堿基取代錯誤外，還發現其他錯誤同樣普遍，包括PCR介導的重組，模板轉換和溫度循環過程中引入的DNA損傷。使用PCR捕獲源自流感病毒RNA的cDNA的另一個挑戰是分離的流感RNA可能已被降解，因此難以通過需要全長片段作為模板的流感通用引物進行擴增。在許多場合下，無法使用亞型特異性引物，因為樣品中流感病毒的類型或亞型是未知的。
美國NIH設計了一種針對所有流感病毒株的捕獲探針。利用所有可用的甲型，乙型和丙型流感病毒序列，獲得了用于設計通用流感捕獲探針集。但探針捕獲的前提是需要有足夠的cDNA才可以實現，同時避免使用PCR引入的錯誤。 因此，美國NIH采用了Nugen公司的Ovation RNA-seq V2試劑盒來富集病毒的cDNA。 該試劑采用了Ribo-SPIA技術，只需4.5小時，即可從500 pg-100 ng的 總RNA中獲得高質量的cDNA樣品。對于降解的樣本（如RIN 2.4）的樣本，同樣會給出驚喜的結果。Ovation RNA-Seq System V2以簡化的工作流程提供了更高的轉錄本覆蓋和均一的測序序列分布。 SPIA技術是取代PCR擴增的一種技術，其原理是單引物的擴增， 同時擴增保證每次的模板是樣品模板，不同于PCR擴增模板可能是上一輪的擴增產物。 SPIA擴增產物無偏向，可用于基因表達差異分析，因此可呈現樣品的原始比列狀態。將該方法應用于從野鳥場監視收集的泄殖腔拭子樣品中，發現這些樣品中的IAV序列和亞型是傳統方法無法檢測到的。
隨后，NIH使用病毒靶向雜交捕獲對來自接受GMP制成的A型流感/加利福尼亞/ 04/2009（H1N1）攻擊的15位志愿者和5位2009年大流行的自然感染流感患者的鼻洗樣本進行了深度測序。在挑戰病毒中發現了十個單核苷酸多態性（SNP）位置。在攻擊患者和自然感染患者中發現了許多SNP位點，其中許多以前未發現。鑒定出的SNP和進化樹分析表明，在挑戰參與者和自然感染的患者中病毒的宿主內部進化是不同的。這項研究使用PCR Free的雜交捕獲技術，提供了一種準確無偏的評估方法，用于評估人體內從統一的流感接種劑到宿主體內不同病毒的進化，并與自然感染的患者進行比較。