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酶聯接免疫吸附劑測定(ELISA）的洗滌優化
閱讀：68 發布時間：2024-11-25 ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫酶技術。ELISA免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發生的高選擇性高特異性識別和結合原理，對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法。優化ELISA的重點之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結合抗體所引起的背景信號，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結合事件被保留，在最后一步產生信號。不充分的洗滌會導致差異和高背景，從而帶來不理想的結果。
在做ELISA實驗時，洗板有兩種方法：手工法洗板和洗板機洗板。二者沒有本質的差別，只要操作合乎要求，均能得到正確、可靠的結果。
手工洗板-重點:
手工洗板人為因素比較大，實驗人員必須經驗豐富，洗滌次數要足夠，沖擊力又不要太大，加入的洗液量以剛滿反應孔為限，防止孔口內有游離酶未能洗凈，同時防止孔與孔之間液體交叉。洗滌結束后扣干亦非常重要，否則易造成假陽性。每次洗完板后，在吸水紙上輕輕拍干，拍板時要垂直，避免交叉感染。用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離;吸水紙要一次性使用，應使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜。酶結合物不耐干燥，特別在較高的溫度下更易失活，所以拍干的反應板應盡量縮短在空氣中暴露的時間，時間越長，吸光度值越低。
手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種方法：
浸泡式:
1.吸干或甩干孔內反應液；
2.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；
3.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1～2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；
4.吸干孔內液體。吸干應徹di，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；
5.重復操作步驟3和4，洗滌3～4次（或按說明規定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯C2H4載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。
洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%～0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
流水沖洗式:
流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹di，且也簡便、快速。
已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。
洗板機洗板-重點:
洗板機洗板人為因素少，速度快，條件恒定，但是使用洗板機洗板時應注意以下三個關鍵點。
洗滌參數:
主要的參數是洗滌量。自動洗板機會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調為高，最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應孔的洗滌量必須相同。
江萊生物ELISA試劑盒的使用手冊中列出包被量。我們建議使用350µl洗滌液進行洗滌，以便清潔整個反應孔的壁。一般來說，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。
洗滌次數:
影響洗滌效果的主要參數是洗滌循環的量。當然，洗滌次數越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會降低信號強度，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復洗滌三次。不過，一般而言，包被平板需要的洗滌次數比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板，必須優化洗滌次數。
控制洗滌量和洗滌次數的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說，96孔板的每個孔能容納330至460 µl。不過，有些自動化洗板機可設置程序，分配遠遠超出這個量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢？其實很簡單，就是在分液的同時打開吸液功能。換句話說，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出。這種技術能增加洗滌量，但不會溢出到其他孔中。
抽 吸:
還有一些參數會影響洗滌步驟的效果。這些參數包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調整，以降低背景（殘留量）和差異。
殘留液體中包含未結合的抗原或抗體，它們會增加背景信號。殘留量越小，殘留液體越少，轉移到下一步的干擾液體也就越少。
吸液高度會明顯影響殘留量；如果洗滌吸頭與反應孔底部的距離稍大，那就會讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應孔底部，那么也會使吸液效率降低，殘留量增加。
目前的洗板機一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動，而剛性洗頭則固定在適當的位置。使用剛性洗頭的洗滌操作在優化起來更為復雜，因為你需要非常仔細地調整吸液高度。如果你們實驗室使用幾種不同的板，那可能會很耗時。在使用浮動洗頭時，吸頭會降到反應孔的底部。調整高度就不是很重要，因此洗頭會下降到底部。
抽吸的位置也對殘留量有著重要影響；如果每個孔只使用一個抽吸點（這很常見，因為更快），那么抽吸的位置需要優化。最佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應孔的中間，即使這是所有洗頭最常見的默認位置。一般來說，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。
反應孔的形狀也會影響殘留量。C形底（平底圓角）的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。
洗板注意：
1.需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于2 μl。
2.及時更換破損吸液針，避免破壞底板包被。
3.針對不同廠家酶標板注意調整吸液頭下降高度，避免沖洗針頭卡住酶標板。
4.注意調整洗液量，洗液量過多將溢出，過少將達不到洗滌效果。
5.關機前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結晶物堵塞管道。
6.不同種試劑盒的洗液嚴禁混合使用。
為了洗滌效果較好，實驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法，在機器洗滌后再進行人工洗板1～2次，能達到理想的洗滌效果。