實時熒光定量PCR：

科研通用RT-PCR試劑盒實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性的定量方法，已得到全世界的*，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。定量PCR除可以對樣品的初始濃度進行準確定量外，還有其它多種豐富的應用。還包括基因表達調控情況的分析、等位基因的分析等。

探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

熒光定量PCR服務：
簡介：實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術服務，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
  我公司根據客戶的樣品數量進行不同的收費標準。
以下產品是公司正在*產品：
 

頭孢吡肟相關物質D標準品D-Glucosamine D-氨基葡萄糖

頭孢吡肟相關物質E標準品VitaminB1 維生素B1（鹽酸硫胺）

頭孢哌酮二水合物標準品VitaminB1 維生素B1（鹽酸硫胺）

頭孢尼西鈉標準品Nitrofurantoin 呋喃妥因

鹽酸頭孢肟標準品L-Homoserine L-高絲氨酸

頭孢美唑標準品L-Homoserine L-高絲氨酸

頭孢雷特標準品Sodium 5-nitroguaiacolate 5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉

頭孢噻肟鈉標準品Sodium 5-nitroguaiacolate 5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉

頭孢替坦標準品EGTA 二醇－雙－（2－氨基基）四酸

頭孢烯懸濁液標準品EGTA 二醇－雙－（2－氨基基）四酸4-氨基-6-(三氟基)苯-1,3-二磺酰胺標準品

Diphenyliodonium  化二苯基鎓

二硫化四基秋蘭姆標準品Decanoyl/octanoyl-glycerides 辛癸酸甘油酯

雙戊酸鈉標準品甘氨酸酯鹽酸鹽

鹽酸多巴酚胺標準品Aldosterone  醛固酮

三水多烯紫杉醇標準品SPDP 氮-琥珀星亞胺-3（2-吡啶二硫代）-酸酯

多西他賽鑒別對照標準品Mangiferin  芒果苷

多西他賽系統(tǒng)適用性鑒別溶液 15mg標準品3,4-Benzopyrene 苯并芘

順—二十二碳六烯酸酯標準品L-Lysine L-glutamate salt L-賴氨酸L-谷氨酸鹽

阿魏酸二十二酯標準品D-Asparagine Monohydrate D-天冬酰胺一水物

磺基二酸-1,4-二(2-基己基)酯鈣鹽標準品

L-Arginine L-aspartate salt L-精氨酸L-天冬氨酸鹽

熒光化學物質：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。PCR產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光 。