CdSe/ZnS量子點在納米藥物研究中的應用
量子點諸多光學優點使其廣泛應用于細胞標記、組織成像、腫瘤識別等生命科學領域。量子點在生物標記中取得的成功促使藥物研發人員將其應用于納米藥物的熒光成像研究。由于納米藥物粒度尺寸小，組成材料和結構復雜，其藥效評價方法 和分析技術手段必將與其原形藥物存在明顯差異。以體內藥物分析中經典的色譜分析技術進行納米藥物靶向效率、藥效評價以及體內行為研究，不僅操作繁瑣，耗資巨大，而且效率較低。熒光成像技術的發展為藥物活體研究提供了新的技術平臺和發展機遇。目前人們可以應用激光共聚焦顯微鏡和近紅外成像系統分別實現細胞和活體水平的熒光信號檢測。而量子點具有熒光效率高、抗光漂白能力強等優勢，將其與熒光成像的方法相結合，則能夠實時動態監測納米藥物在活體細胞或動物體內的行為，并且響應速度快，便于長時間連續觀察。熒光量子點的應用有助于直觀、快速、準確地獲取納米藥物在生物體內分布、轉運、釋放和藥效機理等重要信息，為設計和開發臨床用納米藥物提供技術支持。
1、 量子點納米藥物載體
量子點的表面修飾技術已經比較成熟，表面配體為巰基乙酸、 巰基乙胺或聚乙二醇（PEG）等聚合物的水溶性量子點能夠以靜電結合或共價結合的方式和藥物分子偶聯，形成以量子點為載體的納米藥物復合物，進而實現藥物分子在細胞或動物體內的熒光示蹤研究。
量子點標記抗高血壓藥物卡托普利（Cap），分析其在小鼠體內的藥物動力學和代謝過程。他們利用Cap分子中巰基和量子點的強配位作用，將脂溶性量子點表面的TOPO配體置換，形成QDs-Cap復合物。實驗結果顯示復合物也表現出和Cap 類似的降壓作用。活體成像的熒光信號顯示復合物終主要在肝臟、肺和脾臟蓄積。盡管起藥效的是復合物還是Cap分子等問題尚需進一步驗證，但這一工作為小分子藥物的體內研究提供了新的思路。通過活體熒光成像的方法評價表皮細胞生長因子（EGF）的腫瘤靶向特性和體內動力學。將近紅外量子點和EGF共價相連，形成EGF-QDs納米熒光探針。小鼠尾靜注給藥后，活體近紅外熒光成像顯示EGF-QDs具有 腫瘤內流（約3 min）、清除（約60 min）和蓄積（1-6h）三個特定時相，24 h后腫瘤 熒光下降至基線水平。離體臟器的近紅外熒光和腫瘤組織切片共聚焦顯微鏡分析也證實 其腫瘤特異性蓄積特性。
RNA干擾技術可以通過沉默基因來阻礙特定蛋白的合成，從而達到疾病治療的效果。以量子點作為納米載體，將腫瘤靶向F3多肽和siRNA分子同時標記在量子點表面，實現了siRNA的腫瘤細胞靶向運送和熒光示蹤。量子點作為siRNA載體，除起到熒光示蹤作用外，藥物療效也得到明顯的改善。他們在量子點表面修飾帶有叔胺結構的復合物，形成帶正電的“質子海綿”，從而可以和siRNA通過 靜電作用結合。實驗中通過熒光信號跟蹤復合物進入細胞膜、內涵體中解離、釋放到細胞質等復雜步驟。研究證實，應用該技術向MDA-MB-231細胞內導入siRNA的效率是現有常規方法的10至20倍，而毒性則下降了5至6倍。
2、 納米藥物載體的量子點標記
新型納米藥物載體的研發是納米藥物研究的一個重要組成部分。由于這類開發是針對藥理和藥效基本明確的藥物，通過載體或劑型的改進達到提高療效的目的，因此風險小、見效快，是目前納米藥物研究領域為活躍的一個方向。在生物標記的研究中，為了提高量子點的標記靶向性和生物相容性，科研人員選擇多種生物材料作為包覆物制備成包裹量子點的脂質體、乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米球、聚 D,L-乳酸（PLA）納米球等（見表），為納米藥物載體的量子點標記方法研究奠定了基礎。
⑴ 脂質體
用表面為 TOPO 的脂溶性 CdSe/ZnS 量子點標記了兩性離子甘油-3-磷脂酰膽堿（DOPC）和陽離子1,2-二油酰-3-*銨基丙烷（DOTAP）小單層脂質體（圖A）。低溫透射電鏡（cryo-TEM）顯示量子點通過疏水作用自組裝嵌入到脂質體磷脂雙層膜內。通過共聚焦顯微鏡觀察到兩種脂質體可以結合在人肺上皮細胞表面并被其內吞。進一步將脂質體注射到活體種植的人宮頸 T 癌T 腫瘤內，組織切片熒光表明陽離子 DOTAP 脂質體 T 的腫瘤攝取和保留明顯強于 TDOPC 脂質體。另外一個工作以相似的手 段考察了不同磷脂組成脂質體的細胞靶向性差異。 分別制備了磷脂膜量子點熒光標記的TDOTAP∶二豆冠酰磷脂酰 T 膽堿（TDMPC）（25∶75）和 DOTAP∶二棕櫚酸磷脂酰乙醇胺（DPPE）-PEG2000∶DMPC（25∶0.5∶74.5）的陽離子小單層脂質體，進行 HEK293 細胞標記研究。結果發現種脂質體幾秒鐘就被細胞內吞進入細胞質，而第二種則選擇 性的標記細胞膜，共培養 1 h 后細胞質中也沒有檢測出熒光。
在脂質體膜外表面共價連接量子點“熒光天線”的方法標記免疫脂質體。首先制備含有末端氨基修飾的PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（NH2-PEG-DSPE）的阿霉素載藥脂質體，然后選擇表面為羧基的水溶性CdSe/ZnS量子點作為熒光探針，HER2（人表皮生長因子受體2）作為靶向修飾分子，分別和NH2-PEG-DSPE的氨基共價連接，形成量子點標記免疫脂質體（量子點ILs）（圖B）。共聚焦顯微鏡和流式細胞檢測均證實該量子點ILs對HER2過度表達的SK-BR-3和MCF-7/HER2細胞的靶向特性。腫瘤種植裸鼠靜脈給藥量子點ILs后，通過熒光成像系統觀察發現熒光信號主要分布在單核巨噬細胞T系統和腫瘤部位，T證實該載藥體系具有活體靶向治療作用。
⑵殼聚糖納米球
量子點熒光標記殼聚糖納米藥物載體方向的研究。他們利用水溶性無機納米材料和殼聚糖之間的強靜電作用，成功制備了量子點-（Gd-DTPA）熒光-磁性雙功能標記以及多色量子點標記的殼聚糖納米球。近該小組制備了量子點標記殼聚糖納米粒子作為HER2/neu siRNA的載體（圖C），并通過跟蹤量子點的熒光信號證實藥物載體靶向傳送到SKBR3乳腺腫瘤細胞，用熒光素酶和酶聯免疫分析驗證導入細胞的siRNA的基因沉默效應。這種量子點熒光示蹤的方法將有助于為今后開發、篩選siRNA殼聚糖納米藥物載體，研究其體內藥理特性。
⑶碳納米管
碳納米管（CNT）具有高純度和尺寸一致等優點，對人體毒性較小，在結構上表面積 大，能攜帶大量藥物，并具有藥物緩釋特性，是諸多種類納米藥物載體中的一支新秀。近來也有工作將CNT和量子點這兩種無機納米材料結合開發納米藥物并應用于活體研究。
首先用CdTe量子點共價標記基因治療藥物反義寡核苷酸（ASODNs），并借助聚乙烯亞胺 （PEI）陽離子聚合電解質修飾羧基化的多壁碳納米管（MWNT），然后將ASODNs-量子點和功能化的MWNT以靜電作用方式結合，形成熒光標記的碳納米管載藥系統（圖D）。實驗通過共聚焦熒光成像等手段比較了PEI修飾前后MWNT對HeLa的細胞毒性和ASODNs輸送效率，發現羧基化MWNT在經過聚合物修飾后毒性降低，而細胞核靶向傳送藥物的效率明顯提高。
采用直接用量子點標記MWCNT的方法研究其在動物體內的轉運分布行為。他們將外壁表面羧基化的MWCNT和表面氨基修飾、發射波長為610 nm的CdSe/ZnS量子點偶聯生成MWCNTs-量子點納米藥物載體。將MWCNTs-量子點皮下注射至裸鼠背部和腹部，通過活體熒光監測系統發現明顯的熒光信號。進一步選擇發射波長更長的近紅外 CdSeTe/ZnS量子點，以相同的方式標記MWCNT，并在空腔內裝載抗腫瘤藥物紫杉醇（圖E）。將該復合體系通過尾靜脈注射至裸鼠體內，經過6天的循環代謝，近紅外活體 成像發現肝臟、腎臟、胃和小腸部位顯示明亮熒光，表明CNT納米藥物載體主要在這些臟 器分布蓄積，與通過ICP-MS測定組織內鎘元素含量的結果相吻合。
3、 納米藥物釋放研究
傳統考察納米藥物生物體內釋放的方法主要是通過HPLC-MS等手段測定藥物的總含 量，在實際工作中這類方法往往存在問題。例如，難以對游離藥物和包封藥物分別定量；在生物體內復雜背景下，對某些檢測響應差或痕量藥物的定量也存在技術困難。前述的基于量子點熒光共振能量轉移（QDs-FRET）方法不僅在納米傳感器設計等領域得到了成功應用，近來在納米藥物生物體釋放的研究中也取得一定的進展。
在基因納米藥物開發中，多聚物-核酸復合物用于基因運載的關鍵是在目標細胞DNA能適時地從復合物中卸載，實現有效的基因轉移。這一過程控速步驟的機理闡釋一直是一個難題。借助QDs-FRET方法對這一問題進行研究。將質粒DNA（plasmidDNA）和殼聚糖基因載體分別標記量子點和Cy5染料，組成FRET的供受體對。在復合物未解離時，量子點和Cy5的距離很近，二者可以進行有效的FRET，造成Cy5熒光信號增強。 隨著復合物中DNA的釋放，量子點和Cy5間FRET現象消失，導致量子點熒光增強而Cy5信號 明顯下降（圖11）。基于量子點 FRET信號可以靈敏地檢測復合物穩定性的變化；借助激光共聚焦顯微鏡便可以實時獲取復合物在細胞內攝取和DNA解離釋放信息。 通過圖像定量分析發現在溶酶體、細胞漿及細胞核三區室質粒DNA釋放符合一級動力學模型。該課題組通過相同的手段又比較了殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚磷酸酯作為基因載體的解離動力學，獲取結果與實際轉染效率得到了很好的吻合。用FRET手段分析不同相對分子質量的殼聚糖-質粒DNA復合物的解離情況， 質粒DNA和聚合物載體分別用量子點和德克薩斯紅染料標記。實驗發現隨著殼聚糖摩爾質量增大，HEK29細胞中德克薩斯紅標記殼聚糖的熒光逐漸下降，表明所形成復合物的解離程度更加明顯。另外用熒光光譜監測復合物在pH 7.4和pH 5.0條件下熒光的變化情況，結果證實殼聚糖/DNA復合物的解離主要在酸性條件下發生。
雙FRET體系（Bi-FRETsystem）用于量子點裝載抗腫瘤藥物阿霉素（Dox）在細胞內的釋放研究（圖12）。首先將量子點表面包覆可以識別特異性前列腺膜抗原的A10 RNA核酸適體（Apt），然后和阿霉素溶液混合，使阿霉素內插至核酸適 體的雙鏈，形成[QDs-Apt（Dox）]復合物。藥物扦插作用形成量子點和阿霉素組成的供體-受體對以及阿霉素和核酸適體組成的供體-猝滅體對雙FRET體系，導致了復合物可逆性熒光自猝滅。復合物被前列腺腫瘤細胞識別和攝取后，隨著溫孵時間的延長，阿霉素從復合物中釋放，細胞內量子點和阿霉素的熒光信號均明顯上升，通過測定熒光信號變化，同時實現了腫瘤細胞定位和細胞內阿霉素釋放檢測。
應該注意的是目前應用量子點FRET方法研究藥物動態釋放的工作都僅局限在細胞層次，活體動物研究尚未見報道，主要原因是量子點近紅外活體成像的應用還處于起步階段，諸如近紅外量子點體內性質和基于圖像信號的定量方法等問題的研究還需要深入完善。相信隨著近紅外量子點和近紅外成像技術的發展和成熟，量子點FRET方法也必將在活體動物體內藥物釋放研究中發揮重要作用。
杭州新喬生物科技有限公司是國內的的納米靶向試劑及材料供應商，2017年我公司實驗室新開發上市熒光量子點系列產品（Fluorescent Quantum Dot），我們可以提供4種不同核殼型的熒光量子包括有：CdSe/ZnS硒化鎘-硫化鋅量子點 ，CdS/ZnS硫化鎘-硫化鋅熒光量子點，InP/ZnS磷化銦-硫化鋅熒光量子點，ZnSe/ZnS硒化鋅-硫化鋅熒光量子點四種。同時我們還提供不同表面配體的核殼型熒光量子點產品包括有：十八胺、alkyl、油酸、氨基和羧基。我們的Fluorescentnanocrystals產品還包括脂溶性的和水溶性的，水溶性的是通過外圍包裹一層聚乙二醇PEG而實現水溶性的，表面可以修飾氨基和羧基。
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