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快速深度單克隆抗體 De novo 測序
閱讀：1674 發布時間：2019-5-16抗體藥物的特異性和有效性高度依賴于抗體的氨基酸序列 和抗體上存在的特異性翻譯后修飾。在單克隆抗體的研發 階段，主要是通過 DNA 測序來進行初次驗證，但是對于一 些預臨床的抗體藥物，可能來自于免疫的宿主、商業化的 抗體產品、合作實驗室的抗體樣品或者來自于雜交瘤細胞 的產物，很多都無法得到其 cDNA 序列；在這種情況下， 我們需要直接在蛋白水平進行單抗分子的完整氨基酸序列 及其翻譯后修飾分析，從而解決預臨床實驗中存在的一些 問題，同時對單抗產品的質量進行控制分析。
在沒有蛋白氨基酸序列的前提下進行蛋白的氨基酸 序列和翻譯后修飾分析稱為蛋白從頭測序（de novo sequencing）。實現蛋白從頭測序主要有兩種方法： Edman 降解法和質譜分析法。Edman 降解法一般適合 15-20 個氨基酸組成的肽段，不能超過 30 個氨基酸，且對 于樣品純度要求也比較高，至少 97% 純度以上；同時還 要進行蛋白酶解、肽段分離純化和肽段逐一上機測試，另 外，對于一個單抗進行 Edman 降解測序的時間成本和經 濟成本也比較高。而與傳統的 Edman 降解法相比，基于 質譜的方法更加高通量、率和低成本，即使在已知蛋 白氨基酸序列的情況下，從頭測序的方法也可以發現一些 新的蛋白變體，這些蛋白變體可能來自未知的突變、剪切 拼接和各種翻譯后修飾，從而為單抗序列提供更加全面的 信息，因此基于質譜的蛋白 de novo 測序法已經逐漸進入 生物制藥產品的研發階段。
質譜從頭測序的方法簡單、快速并且直接，但是也存在很 多挑戰：為了得到盡可能豐富的碎片信息，我們需要采用
多種酶酶切和多種質譜碎裂方式組合的高分辨、高質量精 度質譜進行數據采集，然后通過蛋白 de novo 測序軟件的 分析和拼接，得到終的單抗氨基酸序列信息，分析流程 如圖 1 所示。在此，我們使用了 Trypsin，Chymotrypsin， LysC，GluC 和 AspN 5 種酶進行多酶酶切，同時使用我們新的三合一超高分辨質譜 Fusion Lumos 進行高質量的 高能碰撞解離（HCD）和電子轉移解離（ETD）數據采集。 目前，在質譜數據采集過程中，常用的碎裂方式為：碰撞 誘導激活解離（CID）和高能碰撞解離（HCD）兩種解離方式， 由于 HCD 碎裂產生的二級原始譜圖的質量更好，與理論 的匹配度更高，因此我們更多的采用 HCD 來進行二級碎 裂，產生相應的 b，y 碎片離子。而電子轉移解離（ETD） 作為一種補充碎裂方式，可以產生與 b，y 離子互補的 c， z 離子，從而更加準確的確定氨基酸序列；另外 ETD 可以 保留側鏈易于丟失的一些翻譯后修飾基團，比如磷酸化基 團，因此可以準確的確定蛋白質翻譯后修飾的位點；同時由于電子轉移的特征，ETD 偏向于碎裂帶電荷數目比較高、 質核比相對比較低的肽段，從而可以實現一些大肽段的有 效鑒定。綜合考慮，ETD 與 HCD 相互結合，可以準確確 定完整的氨基酸序列以及翻譯后修飾位點的信息。
2 實驗部分 2.1 儀器和試劑
質譜儀器：賽默飛Fusion Lumos（賽默飛世爾科技，美國）；
色譜儀器：Easy Nano1000 液相色譜系統（賽默飛世爾科技， 美國）； 色譜柱：Home made Nano column（C18，2 µm， 75×150 µm，100 Å）；
試劑：色譜級甲酸、二次去離子水、色譜級乙腈；
2.2 儀器方法
色譜分析條件：具體見表 1；
質譜分析條件：具體見表 2；
2.3 數據分析方法
使用 P Novo 軟件對原始譜圖進行 de novo 分析，得到終 的肽段列表，然后再結合單克隆抗體的氨基酸結構特征進行 蛋白水平上的數據整合。
3. 結果與討論 在 這 里， 我 們 使 用 了 Trypsin，Chymotrypsin，LysC， GluC 和 AspN 5 種酶進行多酶酶切，同時使用我們新的 三合一超高分辨質譜 Fusion Lumos 進行高質量的高能碰 撞解離（HCD）和電子轉移解離（ETD）數據采集，并且 通過 P Novo 軟件數據分析和數據整合，得到終的氨基 酸序列信息。
為了得到豐富的肽段和碎片離子的信息，我們使用了 5 種 不同的酶進行酶解，相應的一級色譜質譜流出圖如圖 2 所 示，可以看到使用不同的酶所產生的肽段數目和豐度不 同：LysC 和 Trypsin 主要產生堿性氨基酸結尾的肽段， Chymotrypsin 主要產生疏水性氨基酸結尾的肽段，GluC 主要產生酸性氨基酸結尾的肽段，AspN 主要產生天冬氨 酸開頭的肽段，因此肽段的帶電荷數目和長度不同，也 就造成有些肽段適合進行 HCD 分析，有些肽段適合進行 ETD 分析，所以我們在后續的質譜分析中，分別對同一母 離子進行了這兩種碎裂方式的解離，從而得到完整的 b， y，c，z 離子的信息，更加有利于后續的氨基酸序列的確 定和整合。以其中的一個母離子（ m/z =796.3997，z=3） 為例，如圖 3 所示，可以看到在不同的碎裂方式下，產生 的碎片離子的質核比和強度也是不同的，因此可以得到更 加全面的肽段氨基酸序列的信息。
基于高質量精度、高分辨率和高靈敏度兼具的原始質譜數 據，我們通過 P Novo 軟件搜庫和人工整合后，得到了抗 體的完整序列信息。本文中以 Herceptin 抗體的 de novo 測序為例，終通過 5 種不同酶切和 2 種不同的碎裂方式， 得到了如圖 4 所示的氨基酸序列信息，并且與理論氨基酸 序列*一致，因此我們可以證明該分析流程可以直接應 用到常規抗體的 de novo 分析中。
針對單抗重要的 CDR 區域，我們對來源于該區域肽段 的 HCD 和 ETD 原始譜圖分別進行了確認。以輕鏈區域的 RASQDVNTAVAWYQQKPGK 為例，該肽段對應的 HCD 和 ETD 碎片離子匹配譜圖如圖 5 所示，HCD 碎裂譜圖中碎片 離子的覆蓋度為 78%，ETD 碎裂譜圖中碎片離子的覆蓋度 為 86%，兩者結合可以實現碎片離子的* 覆蓋，由此 我們可以確定該 CDR 區域的氨基酸序列信息。同理，其它 的 CDR 區域也都分別進行了 HCD 和 ETD 譜圖的確認，另 外對于 Fab 和 Fc 區域，也都進行了譜圖確認。由此可見 該分析流程可以準確、快速的應用到其它的蛋白藥物的 de vovo 分析中。
4. 結論 本文基于新的三合一超高分辨質譜平臺 Fusion Lumos, 通 過 Trypsin，LysC，Chymotrypsin，GluC 和 AspN 5 種酶進 行多酶酶切，采用 HCD 和 ETD 兩種互補碎裂方式，以及后 續的軟件分析和人工確認，建立了單抗藥物簡單、快速的 De novo 質譜測序分析流程，為未知氨基酸序列蛋白藥物的 分析和確認提供了質譜方法，有望大規模應用于生物制藥企 業的早期研發中。