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使用紫外-可見光譜法對蛋白質和核酸超微量樣品進行濃度分析
閱讀:182 發布時間:2024-11-14摘要使用配備 TrayCell 2.0 超微量比色池的 Agilent Cary 60 紫外-可見分光光度計分析了蛋白質和核酸樣品。無損測量微量樣品有利于樣品保存、樣品處理,并且無需執行繁瑣且容易出錯的稀釋操作。使用 TrayCell 2.0 既快捷又簡單,可幫助用戶改進工作流程。
前言現代化實驗室越來越多地在尋求無需稀釋即可分析 DNA、RNA 和蛋白質等樣品的準確、精確且易于使用的方法。Agilent Cary 60 紫外-可見分光光度計配備 TrayCell 2.0 超微量比色池,該比色池帶有合適光程的蓋子,為直接測量超微量樣品提供了一個方便且易于使用的平臺。可以分別使用短光程和長光程蓋子分析高濃度和低濃度樣品,確保寬動態范圍。該方法是一種無損分析方法,可以回收珍貴的樣品,并且 TrayCell2.0 易于清潔,提高了該技術的可用性。Cary 60 紫外-可見分光光度計(圖 1)專為重復的常規應用以及更高級的應用而設計。這款雙光束儀器配備強大、高度聚焦的脈沖氙燈。這種燈可大幅提高穿過樣品的光通量,確保高質量的光度測量結果。因此,Cary 60 紫外-可見分光光度計是準確且可重現地測量少量樣品的理想之選。脈沖氙燈僅在采集數據時照射樣品,保護敏感樣品免受光降解并降低功耗。此外,Cary 60 紫外-可見分光光度計不受室光干擾帶來的失真影響。Cary 60 紫外-可見分光光度計的室光免疫性能支持在開放的樣品室中操作,易于使用,并且降低了由于處理錯誤而導致數據質量降低的風險。與因儀器限制而可能產生不準確或不可重復結果的現有方法相比,高性能 Cary 60 紫外-可見分光光度計可提供更優質的數據。
邁向更可持續發展的實驗室Cary 60 紫外-可見分光光度計的環境影響已經過獨立審計,并獲得了由 My Green Lab 認證的 ACT(歸責性、一致性和透明度)標簽。該標簽提供了有關 Cary 60 紫外-可見分光光度計在其整個生命周期中對環境影響的信息(圖 2)。Cary 60 紫外-可見分光光度計改善了實驗室對環境的影響,而不會影響分析效率或科學進步。
在典型的吸光度測量中,TrayCell 2.0 超微量比色池(貨號 G6871C)置于 Cary 60 紫外-可見分光光度計的標準樣品池支架中。TrayCell 2.0 可以配備可更換蓋,提供四種不同的光程:2.0 mm(貨號 G6871-68005)、1.0 mm(貨號G6871-68004)、0.2 mm(貨號 G6871-68003)和 0.1 mm(貨號 G6871-68002),具有寬動態范圍。將超微量樣品(0.7–10 μL,取決于光程)吸取至 TrayCell 2.0 的測量窗,然后將具有選定光程的相應蓋子置于上方。來自 Cary 60 紫外可見分光光度計的高度聚焦光束經過 TrayCell 2.0 中的光纖直接穿過樣品(圖 3)。然后,光束被蓋子中的反射鏡反射回到分光光度計檢測器中,重新穿過樣品,如圖 4 所示。
在將下一個樣品置于 TrayCell 2.0 的測量窗之前,需要清潔窗片以及蓋子內的反射鏡。在清潔窗片期間,無需從樣品池支架上取下 TrayCell 2.0。窗片與蓋子內的反射鏡之間準確的間距可確保準確的光程,并在每次測量中保持不變。在本研究中,使用配備 TrayCell 2.0 超微量比色池的 Cary 60紫外-可見分光光度計測量超微量蛋白質和 DNA 樣品。使用TrayCell 2.0 的不同光程蓋選件,以減少稀釋,并擴展樣品的可測量濃度范圍。使用牛血清白蛋白 (BSA) 和鯡魚精子 DNA樣品,展示了配備 TrayCell 2.0 的 Cary 60 紫外-可見分光光度計的光度測量性能。
儀器和材料– Agilent Cary 60 紫外-可見分光光度計– TrayCell 2.0 超微量比色池– BSA 蛋白:將已知量的 BSA 蛋白(Sigma-Aldrich,CAS9048-46-8)溶解于 PBS 緩沖液(磷酸鹽緩沖液)中,配制 400 mg/mL 儲備液。連續稀釋儲備液,配制一組不同濃度的樣品– 鯡魚精子 DNA:將已知量的鯡魚精子 DNA(Sigma-Aldrich,CAS 438545-06-3)溶解于 PBS 緩沖液中,配制 5 mg/mL儲備液。連續稀釋儲備液,配制一組不同濃度的樣品使用移液器將超微量 (3 µL) 樣品置于測量窗上,并使用 AgilentCary WinUV 軟件 5.1.3.1042 版進行數據采集。
結果與討論低濃度下的光度測量重現性為了評估配備 TrayCell 2.0 的 Cary 60 紫外-可見分光光度計的可用吸光度范圍,對高濃度和低濃度樣品進行了測量。對于樣品量有限的低濃度測量,TrayCell 2.0 是理想之選,因為它只需要超微量樣品即可進行測量。此外,Cary 60 紫外-可見分光光度計足夠靈敏,可以測量低濃度樣品,而許多分光光度計的靈敏度不支持測量濃度低于 25 ng/µL 的樣品。分光光度計在低濃度下的性能至關重要,因此需要執行波長掃描以確保觀察到典型的樣品曲線。使用配備 TrayCell 2.0(帶 1.0 mm蓋子)的 Cary 60 紫外-可見分光光度計對 20 ng/µL 鯡魚精子DNA 樣品進行十次重復波長掃描。該樣品的吸光度為 0.04,相當于標準 10 mm 比色池中的 0.4 Abs。如圖 5 所示,Cary60 紫外-可見分光光度計可進行高度可重現的波長掃描,這對于超微量分析十分重要。