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液相色譜系統對飼料中的辣椒玉紅素和辣椒紅素進行分析
閱讀：155 發布時間：2024-11-28摘要：本文介紹了使用 Agilent Poroshell 120 EC-C8 反相色譜柱結合 Agilent 1200 液相色譜系統測定飼料中辣椒玉紅素和辣椒紅素的分析方法。在 0.01-5 μg/mL 的濃度范圍內，兩種目標化合物的相關系數均高于 0.99，表明該方法具有良好的線性。方法定量限為 100 μg/kg，檢測限為 50 μg/kg。在加標濃度為 100–500 μg/kg 時，肉中鴨飼料中兩種目標化合物的平均加標回收率和相對標準偏差分別在 83.3%–106.0% 和 1.0%–6.5% 之間，表明該方法具有出色的準確度和精密度，適用于測定飼料樣品中的辣椒玉紅素和辣椒紅素殘留。對兩種市售飼料添加劑樣品進行方法干擾測定考察，結果表明目標化合物峰處無干擾峰，可實現準確定量。
前言辣椒玉紅素和辣椒紅素是辣椒紅色素中極性較大的紅色組分，占總量的 50%–60%，其結構和性質見表 1。它們從成熟的紅辣椒中提取，安全無毒且性狀穩定，著色性好，在肉類、糕點、飲料等食品工業中有著廣泛應用。另外，將其添加于飼料中，可通過在動物皮膚、脂肪等不同組織中沉積而使肉禽及水產品著色，例如添加到雞、鴨飼料中可顯著改善蛋黃色澤，因此在飼料領域中也有廣泛的應用[1]。目前針對辣椒玉紅素和辣椒紅素的高效液相分析方法多為正相色譜法，需要使用丙酮和正己烷等試劑，并且在正相模式下需要對常規使用的反相液相色譜儀器配件進行更換。本應用使用 AgilentPoroshell 120 EC-C8 反相色譜柱并結合 Agilent 1200 高效液相色譜系統，建立了用于飼料和飼料添加劑中辣椒玉紅素和辣椒紅素的高效液相分析方法。
實驗部分試劑和樣品實驗用甲醇、乙腈均為色譜純，購于北京迪馬科技有限公司；實驗用水為娃哈哈純凈水；辣椒玉紅素和辣椒紅素標準品濃度均為100 µg/mL，購于成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，以乙腈為溶劑；飼料和飼料添加劑樣品均為市售產品。儀器和設備采用 Agilent 1200 液相色譜系統，其配備 Agilent 1260 DAD 檢測器（貨號 G4212B）、Agilent 1200 TCC SL 柱溫箱（貨號 G1316B）、Agilent 1200 Hip-ALS LS 自動進樣器（貨號 G1367D）和 Agilent1200 BI-PUMP 二元泵（貨號 G1379B）。色譜柱選用 Agilent Poroshell 120 EC-C8（3.0 × 100 mm，2.7 μm；貨號 695975-306）。樣品前處理采用 Agilent Captiva RC 微孔濾膜（0.2 μm，13 mm；貨號 5190-5108)、Agilent ValueLab 尼龍微孔濾膜（0.2 μm，13 mm；貨號 5191-4286）和安捷倫陶瓷均質子（用于 50 mL離心管；貨號 5982-9313）。
標準品制備分別取適量的標準品用乙腈配制濃度為 10 μg/mL 的混合標準工作液，備用。校準標樣的配制：分別準確移取上述適量混合標準工作液，用80% 乙腈水溶液稀釋得到濃度分別為 0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1 和 5 μg/mL 的系列校準標樣，現配現用。樣品前處理稱取樣品 2 g（精確至 0.01 g）于 50 mL 離心管中；加入 10 mL乙腈，渦旋振蕩 5 min；以 8000 r/min 離心 5 min；取 800 μL 上清液，加入 200 μL 水；過 0.2 μm RC 微孔濾膜，待測。
液相色譜條件色譜柱： Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 µm進樣量： 10 μL流速： 0.5 mL/min柱溫： 40 °C流動相： A) 水 B) 乙腈梯度程序： 時間 (min) B (%) 0.0 75 1.0 100 6.0 100后運行時間 5 min檢測器： DAD，波長 474 nm，帶寬 4 nm；參比 360 nm，帶寬 100 nm
結果與討論液相色譜柱的選擇本應用考察了兩種具有相同規格的反相色譜柱：Poroshell 120EC-C8 和 EC-C18，在上述流動相條件下得到的辣椒玉紅素和辣椒紅素的色譜圖，如圖 1 所示。從圖中可以看出，與 EC-C8 色譜柱上的結果相比，辣椒紅素在 EC-C18 色譜柱上的保留更強，色譜峰和雜質峰未得到有效分離且響應較低，這與其 LogP 值較大有關。而使用 EC-C8 色譜柱時，辣椒玉紅素和辣椒紅素峰與雜質峰均能得到很好地保留和分離，峰形尖銳且對稱。最終采用 Poroshell 120 EC-C8 色譜柱，并在上述液相條件下連續進樣6 針， 結果發現峰面積和保留時間的重復性均良好。
結論本研究將 Poroshell 120 EC-C8 色譜柱與 Agilent 1200 液相色譜系統相結合，建立了一種定量測定飼料和飼料添加劑中辣椒玉紅素和辣椒紅素的分析方法。使用短碳鏈鍵合的 Poroshell 120 EC-C8 色譜柱相比于 C18 鍵合相，能夠使辣椒玉紅素和辣椒紅素獲得更好的保留和分離，得到對稱、尖銳的峰形，且重復性優異。使用外標法定量，該方法在 0.01-5 μg/mL 的濃度范圍內表現出良好的線性，線性相關系數高于 0.99。使用乙腈對飼料樣品進行提取，在加標濃度為 100、 200 和 500 μg/kg 時，目標化合物的平均回收率在 83.3%–106.0% 之間，且相對標準偏差在 1.0%–6.5% 之間，表明該方法具有良好的準確度和精密度。方法的檢測限為 50 μg/kg，定量限為 100 μg/kg，具有出色的靈敏度。同時對兩種市售飼料添加劑樣品進行檢測，在本應用建立的色譜條件下獲得了良好的峰形且目標峰處無干擾峰存在。因此，本文所述的方法適用于飼料中辣椒玉紅素和辣椒紅素的測定。