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液質聯用儀測定動物源食品中的潮霉素 B
閱讀：154 發布時間：2024-11-29摘要：本文使用 Agilent Bond Elut PBA 固相萃取凈化并結合安捷倫液質聯用儀HPLC-MS/MS，建立了一種測定不同動物源食品（豬肉、豬肝、豬腎、羊肉、牛奶、雞蛋）中潮霉素 B 的檢測方法。在 10–500 ng/L 的濃度范圍內，使用同位素內標校正所得到的線性相關系數高于 0.99；各種動物源食品中潮霉素 B 的方法檢測限為 10 μg/kg，定量限為 20 μg/kg；在加標濃度為 20–250 ng/g 時，不同目標物的平均加標回收率和相對標準偏差分別在94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范圍內。該方法適用于多種動物源食品中潮霉素 B 殘留的測定。
前言：潮霉素 B 是由吸水鏈霉菌產生的一種氨基糖苷類抗生素。其能夠抑制蛋白質合成，從而殺死細菌、真菌和高等真核細胞，可有效控制豬蛔蟲、食道口線蟲和毛首線蟲感染（例如，在妊娠母豬全價飼料中添加潮霉素 B，能夠保護仔豬在哺乳期間不受蛔蟲感染），同時對雞蛔蟲、雞異刺續蟲和禽封閉毛細線蟲均有良好的控制效應[1]。GB 31650-2019[2] 中規定潮霉素 B 可用作治療，但不得在動物性食品（可食組織、雞蛋）中檢出。因此，非常有必要建立動物源食品中潮霉素 B 的檢測方法。GB/T 21323-2007[3] 介紹了一種檢測動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定方法。該方法使用磷酸-三氯yi酸緩沖液進行提取，并使用離子對試劑七氟丁酸降低氨基糖苷極性，然后通過 C18 固相萃取柱進行凈化。但該方法中的七氟丁酸使用量大，成本較高，且向流動相含有 20% 100 mmol/L 七氟丁酸會對質譜系統造成污染。本文在該標準的基礎上，對樣品前處理過程進行了改進。采用yi酸銨-三氯yi酸緩沖溶液進行提取，并通過具有機理的 Bond Elut PBA 進行固相萃取凈化，其硅膠基體上鍵合的苯硼酸官能團對潮霉素 B 結構中的順式-二醇官能團具有較強的選擇性，在堿性條件下通過可逆共價鍵被保留，然后在酸性條件下洗脫，從而實現高選擇性保留和凈化效果。另外，該方法使用內標法進行定量，僅在上機前定容溶液中加入七氟丁酸，可避免污染系統。由此建立了一種適用于快速、簡便地檢測多種動物源基質中潮霉素 B 的方法。
實驗部分試劑和樣品實驗用乙腈、甲酸、七氟丁酸均為色譜純，購于北京迪馬科技有限公司；實驗用水為娃哈哈純凈水。潮霉素 B 和 d4-潮霉素 B 標準品：100 μg/mL（BePure，購于曼哈格公司，以水為溶劑）。基質樣品為市售產品。儀器和設備采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜/6470 三重四極桿液質聯用(LC/MS/MS) 系統；Agilent Vac Elut 20 位固相萃取裝置。所用其他主要設備包括 3K-15 離心機（德國 Sigma 公司）和渦旋混勻器（德國 IKA 公司）。色譜柱采用 Agilent Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 μm（部件號 695975-306）。樣品前處理采用 Agilent Bond Elut PBA（100 mg，3 mL，部件號 12102127）、Agilent ValueLab PES 微孔濾膜（0.2 μm，13 mm，部件號 5190-5273）、安捷倫陶瓷均質子（用于 50 mL離心管，部件號 5982-9313）。溶劑和標樣配制分別取適量的標準品用乙腈:水 (50:50, V/V) 配制濃度為 10 mg/L的潮霉素 B 和 d4-潮霉素 B 內標標準工作液，逐級稀釋備用。校準標樣的配制：分別準確移取上述適量標準工作液，用 0.5%甲酸水（含 1% 七氟丁酸）稀釋成濃度分別為 10、20、50、100、200、500 和 1000 μg/L 的標準溶液，其中內標濃度為50 μg/L，現配現用。 然后向其中加入 50 g 三氯yi酸，溶解并混勻后，加水定容至 1000 mL，搖勻后備用（在 4 °C下可保存 1 個月）。
樣品前處理稱取樣品 5 g (±0.05 g) 于 50 mL 離心管中，添加一定量的內標；加入陶瓷均質子，向其中準確加入 5 mL 銨-三氯yi酸緩沖溶液，渦旋振蕩 5 min；以 8000 r/min 離心 5 min，將上清液全部轉移至15 mL 離心管中；將剩余殘渣用 5 復提取一次，以 8000 r/min 離心 5 min 后合并上清液； pH = 8.5 (±0.2)，定容至 12 mL（將牛奶定容至 15 mL）；然后以 8000 r/min 離心 5 min，所得上清液用作備用液。將 Bond Elut PBA 固相萃取柱依次用 2 mL 乙腈、3 mL 0.5% 甲酸水、5 mL 0.2 mol/L (pH = 8.5) 活化；取一半體積的備用液 (6 mL) 過柱（對于牛奶，則取 7.5 mL）；待樣品液全部流出之后，依次用 3 mL 0.2 mol/L (pH = 8.5) 和 3 mL 水淋洗，并抽干 2 min；加 2 mL 0.5% 甲酸水分兩次洗脫；向洗脫液中加入 20 μL 七氟丁酸，渦旋混勻后，過 0.2 μm PES 濾膜，待液相色譜-串聯質譜儀測定，前處理流程圖見圖 1。
液相色譜條件儀器 Agilent 1290 Infinity II 高速泵（部件號 G7120A）Agilent 1290 Infinity II 進樣器（部件號 G7167B）Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱（部件號G7116B）色譜柱 Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 μm流動相 A：0.5 mmol/L 乙酸銨，0.1% 甲酸水溶液B：乙腈流速 0.3 mL/min梯度 時間 (min) B (%)0 22.0 22.1 85.1 407.0 908.0 90后運行時間 3 min柱溫 40 °C進樣體積 10 μL
檢測限和定量限通過空白基質中的加標回收試驗來確定方法的檢測限和定量限。當加標濃度為 10 µg/kg 時仍可定性檢出，目標物色譜峰的信噪比(S/N) 大于 3，由此確定該方法的檢測限為 10 µg/kg；當加標濃度為 20 µg/kg 時，信噪比 (S/N) 大于 10，且回收率和重現性均能滿足相關國家標準要求，由此確定該方法的定量限為 20 μg/kg。回收率和精密度本應用選擇幾種代表性的動物源食品，即豬肉、豬肝、豬腎、羊肉、牛奶和雞蛋，分別添加 20、50、250 μg/kg 三個濃度樣品，且每個加標水平設六個平行樣，以此驗證方法的準確度和精密度，結果見表 2。潮霉素 B 在不同動物源食品中的平均回收率和相對標準偏差分別在 94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范圍內，表明該方法具有良好的準確度和精密度。不同動物源食品中基質空白和潮霉素加標回收色譜圖見圖 3。
結論本文采用 HPLC-MS/MS 結合 Poroshell 120 EC-C8 色譜柱建立了一種檢測動物源食品中潮霉素 B 的方法。該方法與 GB/T 21323-2007 相比，在上機前溶液中加入七氟丁酸，可大幅減少七氟丁酸的使用量并避免了離子對試劑對儀器的污染。同時，采用共價機理的 Agilent Bond Elut PBA 固相萃取柱對潮霉素 B 具有高選擇性，可實現出色的凈化效果。該方法簡便、高效，在 10–500 ng/mL 的濃度范圍內具有良好的線性（線性相關系數 R2 高于 0.99）；且靈敏度出色（檢測限為 10 μg/kg，定量限為 20 μg/kg）；不同動物源樣品基質中潮霉素 B 的平均加標回收率和相對標準偏差分別在 94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范圍內，表明其具有良好的準確度和精密度。該方法適用于測定多種動物源食品中的潮霉素 B 殘留。