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逆轉錄實驗操作重點干貨分享
閱讀：124 發布時間：2024-11-25逆轉錄（reverse transcription）是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程，即 RNA 指導下的 DNA 合成，逆轉錄實驗包括3大要素，分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板：
1. 引物：逆轉錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個 T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對，可合成全長的 cDNA，但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ，對模板質量要求高，較適合克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個堿基，可隨機識別模板并結合，適合復雜結構和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續 qPCR 實驗。基因特異性引物可以識別特定模板序列，具有特異性強，靈敏度高的特點，但需合成特定的序列。所以根據不同實驗需求可進行相應引物的選擇。
2. 逆轉錄酶：一種是來自純化的禽成髓細胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性，它最適溫度是42℃，最適 pH8.3，在高反應溫度時可消除 mRNA 的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性，最適溫度37℃，最適 pH7.6，較弱的 RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長 cDNA 有很大好處。
3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度計檢測純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進行瓊脂糖凝膠電泳時會產生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品），28S rRNA 條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無 gDNA 和蛋白殘留。
上面給大家簡單介紹了一下逆轉錄的3大要素，除此之外在實際的操作過程中，還會有各種各樣的讓問題我們措手不及，下面給大家一一詳細解答！
1. 如何提高 RT-PCR 反應的靈敏度與特異性？
① 確定模板 RNA 完整性好，無 DNA 污染。
② RNA 模板中不應含有擴增反應抑制劑。
③ 使用適量的模板 RNA ，模板量太多會降低特異性，太少會導致擴增不出條帶或條帶太弱。
④ 若模板中有二級結構，可通過提高逆轉錄反應溫度來提高擴增效果。
2. RNA 中含有逆轉錄抑制劑時，怎么處理？
逆轉錄抑制劑包括：SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等等。可將已確定的高質量 RNA 模板同樣品混合，同高質量 RNA 模板比較產量以檢測 RNA 抑制劑；若高質量模板 RNA 與樣品混合后產量降低，則說明樣品中存在逆轉錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對 RNA 沉淀進行清洗，以除去抑制劑。
3. 逆轉錄后的 qPCR 實驗 Ct 值偏大或者普通 PCR 產量低。
① RNA 模板質量差，需要重新制備 RNA 模板，可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。
② 逆轉錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉錄試劑成分，可能會對后續的PCR 產生抑制作用，所以可以適當梯度提高 cDNA 稀釋比例（通常來說可將 cDNA 原液稀釋5-10倍，其最佳模板加入量以擴增得到的 Ct 值在20-30個循環為好）。
③ 起始的 RNA 模板量低，需要減少稀釋倍數或增加 RNA 模板量。
④ 基因本身原因（復雜和長度），可以重新設計復雜基因的引物，避免復雜結構。或者用三步法程序或延長兩步法程序的延伸時間。
⑤ 逆轉錄或者定量產品性能差，可以通過做平行不用品牌產品對比實驗，對比逆轉錄產品性能。
4. 逆轉錄酶擴增效率評估，應該關注哪些指標？
建議： qPCR-ct 值，或者 PCR 產量
如果想比較逆轉錄性能，最為直接的還是后續做 qPCR 或者 PCR 平行對比實驗，這種方法相對較為準確。
不建議：cDNA 中間產物濃度測定 or 其他方法。
逆轉錄完成后是不建議測定產物濃度的，由于逆轉錄后產生 RNA-cDNA 雜交鏈，溶液中的 RNA 和部分 DNA 會對吸光值產生影響，所以測定出來的產物濃度并不準確，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進行對比實驗，由于不同品牌之間的逆轉錄體系具有或多或少的差異，其體系中的各種離子等都能對吸光度產生影響，所以測定的結果也沒有可比性。
優化及注意事項：
① 逆轉錄 PCR 時，提取 RNA 是關鍵，需分離高質量 RNA（純度和完整性）。
② 整個操作過程需使用去 RNA 酶的槍頭、EP 管等耗材。
③ 逆轉錄過程中要謹防 RNA 酶的污染，加入 RNA 酶抑制劑。
④ 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。
⑤ 逆轉錄實驗應全程在冰上操作完成，操作過程應避免 RNase 污染。
⑥ 提高逆轉錄預熱溫度（也可根據相應逆轉錄試劑盒進行調整）。
⑦ 減少基因組 DNA 污染，可使用去基因組的逆轉錄試劑盒。