操作流程:
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存。
特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
豬鏈球菌檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書 | 50T | FS-01H4037 |
PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
產(chǎn)品特點:
◇高特異性:與其他病毒無交叉反應(yīng),無非特異性擴增;
◇高靈敏度:檢測靈敏度可達10~100拷貝;
◇操作簡便:該系列所有試劑均采用相同的體系和條件,可同時進行多個檢測;
◇高通量:多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現(xiàn)性定量方法,已得到的*,廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物,內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標為對照定量待檢測
小檗皮 規(guī)格: 1g
604-80-8仙;仙甙;異鼠李-3-O-β-D 規(guī)格: HPLC≥98%,20mg/支
28649-60-7環(huán)氧續(xù)隨子 規(guī)格: 20mg
人生長激釋放抑制因子 規(guī)格: 2mg/支
美決明子 規(guī)格: HPLC≥98%;20mg
91-64-5香 規(guī)格: 20mg
33342-05-1格列喹 規(guī)格: HPLC≥98%;20mg
73-40-5鳥 規(guī)格: 20mg
反腺原氨 規(guī)格: 23ng/支
35286-59-0地榆皂Ⅱ;Ziyuglycoside 規(guī)格: 20mg
豬鏈球菌檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書Phospho-PDGFRA(Tyr988) 磷化小板源性生因子受體α 規(guī)格: 0.1mlp73 alpha p53相關(guān)P73α抗體 規(guī)格: 0.2ml
Rabbit Anti-chicken IgG/Gold 膠體金標記的兔抗雞IgG 規(guī)格: 0.5ml
C9orf117 9號染色體開放閱讀框117抗體 規(guī)格: 0.2ml
Ryanodine Receptor 心肌蘭尼受體抗體(腦肌蘭尼受體) 規(guī)格: 0.2mlFLIP 凋亡調(diào)節(jié)基因之一抗體(短型) 規(guī)格: 0.1ml
CKI γ3 酪激1γ3抗體 規(guī)格: 0.2mlKLC1/KNS2 驅(qū)動2抗體 規(guī)格: 0.2ml
SEL1L SEL1L抗體 規(guī)格: 0.1ml
EPDR1 哺動物室管膜相關(guān)1抗體 規(guī)格: 0.2ml
phospho-EPH A3+A4+A5 ( Tyr779) 磷化內(nèi)皮細胞受體激A3+A4+A5抗體 規(guī)格: 0.1ml
CLEC2/CLEC1B C型凝集結(jié)構(gòu)域家族1成員B抗體 規(guī)格: 0.2ml
AF6/Afadin 絲狀肌動結(jié)合抗體 規(guī)格: 0.2ml
Profilin 1 前纖維1抗體 規(guī)格: 0.1mlGMRP1/BTBD10 糖代謝相關(guān)1抗體 規(guī)格: 0.2ml
使用方法:
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。
1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,*用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照(濃度為 1×10E8 拷貝/μL,試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA,本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8. 如果有 N 個樣品,則需要進行 N+2 個樣品提取,多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)(20μL 體系,在樣品制備室進行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6 個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于PCR 陽性對照。