Virus DNA/RNA cDNA Synthesis Kit公司正在出售的產品：鮭魚胚胎細胞　磷化細胞信號轉導分子SMAD2封閉多肽　河蟹顫抖病病毒PCR檢測試劑盒　大鼠上皮中性粒細胞活化肽78(ENA-78/CXCL5)ELISA Kit　尿氮活性比色法檢測試劑盒　快生芽孢桿菌　17號染色體開放閱讀框49抗體

商品屬性：

描述：本試劑盒采用穩(wěn)定高效的反轉錄預混體系 5×Golden RT MasterMix 進行 RNA 的反轉錄反應，使用時只需加入模 板、引物和 RNase Free H2O 即可，大大簡化了操作過程、 提高了效率、減少了操作過程中的人為誤差。具有快速簡便、 重復性高、特異性好、靈敏度高和穩(wěn)定性好的特點。專用于 病毒 DNA/RNA 樣品的反轉錄反應。 該預混體系包含點突變致 RNase H 活性缺失的 Golden MLV Reverse Transcriptase 反轉錄酶、dNTP、反應 Buffer 和 RNase Inhibitor。該試劑盒采用的反轉錄酶去除了 RNase H 活性，從而避免反轉錄過程中降解 RNA。同時經過突變文 庫篩選，使得其熱穩(wěn)定性更強，可耐受 55℃高溫反應。相比 于低溫條件下反轉錄反應，采用高溫反轉錄可顯著打開 RNA 二級結構，從而提高復雜 RNA 模板的擴增性能、提高反轉 錄 cDNA 的長度和產量，從而提高后續(xù)檢測的靈敏度。合成 的第一鏈 cDNA 可廣泛用于 2nd Strand 的合成、雜交、PCR 擴增、Real-Time PCR 反應等。

組分

儲存：請置于-20°C，可保存 3 年；避免反復凍融。
注：如 5×Golden RT MasterMix 出現沉淀屬正常現象，可用手捂化，混合均勻后使用不影響實驗結果。一步法 cDOn
1. 按以下組分配制反轉錄反應液
病毒 DNA/RNA 樣品 2~10μl
5×Golden RT MasterMix 4μl
*20×Random Primer 1μl
Rnase Free H2O Up to 20μl
*注：反轉錄引物可根據需要改用特異性引物。
2.根據實際情況反轉錄可選擇快速程序或標準程序
快速程序
 37°C 15~30min（cDNA 合成）
 85°C 5min（失活 MLV）
標準程序
 25°C 10min（引物配對）
 55°C 30~60min（cDNA 合成）
 85°C 5min（失活 MLV）
注：通常在定量 PCR 實驗中使用快速程序進行反轉錄（反轉錄效率>80%），在進行高 GC 含量、含復雜二級結構、長片段的模板轉錄時采用標準程序（反轉錄效率>100%）。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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