HotStart Bst 4.2 Basic Mix(可凍干)公司正在出售的產品：鼻咽癌細胞　細胞色cP450 CYP26A1封閉多肽　牛免疫缺損病毒PCR檢測試劑盒　大鼠尿激型纖溶原激活物受體(PLAUR/uPAR)ELISA Kit　海藻糖6磷合成(TPS)活性比色法檢測試劑盒　成對桿菌　肌肉特定環指蛋白3抗體

公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

描述：

2.5xBst4.2 Basic Mix 包含了 Helicaser、dNTP、Mg2+、反應緩沖鹽、凍干賦形劑和穩定劑。HotStart Bst4.2DNA/RNA 聚合酶為單獨的組分。本品不僅可作為常規檢測試劑，對于具有凍干經驗的研究者，
本品還直接進行后續凍干，無需再加入任何其它輔料。

Bst4.2 具有以下性能：
（1）Bst 4.2 全系包含熱啟動Aptamer，該配體確保酶在<30℃時，酶活封閉效率>95%,在>60℃時 1min 內釋放酶活。該特性利于室溫建立反應體系，并大幅降低了低溫條件下的非特異擴增；
（2）反應溫度提升到 70℃，大幅降低引物 Dimer 的形成，提高擴增特異性，并使得粗樣品核酸釋放更加充分；
（3）全系包含 Helicaser，因此，允許在不使用 F3/B3 引物的情況下進行 LAMP 擴增（easy LAMP），并允許 FIP/BIP 的引物用量降低一倍。這將進一步降低非特異擴增，并使得擴增均一性大幅提升。本品為多用途的試劑，適用于 LAMP 進行 MolecularBeacon 探針、DP-LAMP 探針、試紙條等檢測。

儲存：長期保存請置于-20℃以下（12 個月有效）；制品反復凍融10 次不影響性能，但應避免反復凍融；制品由于含有高濃度的糖組分，-20℃保存的制品，在融化時可能會有結晶物。此時 2.5xBst4.2Mix 可在 37℃進行融化，而 Bst4.2 酶制品在 30℃的溫度下融化，過高的溫度可能會導致熱啟動性能下降。一經融化推薦置于2-8℃保存，在此條件下制品穩定儲存 6 個月。
特殊說明：
（1） Bst4.2 DNA/RNA Polymerase 在用于 LAMP 擴增時的推薦反應溫度為 65-70℃，最佳反應溫度為 70℃。因此其可替代 的 Bst4.0 系列，用于標準 LAMP 的擴增。
（2） 由于 Helicaser 的反應溫度為 70℃，因此在進行 eLAMP 擴增時，反應溫度為 70℃。
（3） 制品中包含高濃度的鹽組分，使用時做好個人防護，防止制品與皮膚、眼、鼻、呼吸道等接觸和吸入，一旦接觸或吸入，請用大量的清水沖洗。
（4）防止氣溶膠污染，盡可能進行分區操作。
1. 標準 LAMP 和 eLAMP 擴增的區別本試劑既可以用于標準 LAMP 擴增，也可以用于 eLAMP擴增。
1.1 10x 標準 LAMP Primer MixFIP/BIP=16 μM each; LF/LB=4 μM each; F3/B3=2 μM each
1.2 10xeLAMP Primer MixFIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each
注意：eLAMP（easy LAMP）為去除 F3/B3 引物的方法，為 Bst4.2系列專用的使用策略，對于大多數引物組，在 Helicaser 的加持下，擴增速度幾乎不受影響。如引物擴增效率低，可提高 FIP/BIP 濃度到 12~16uM。
1.3 擴增溫度不同標準 LAMP 擴增 eLAMP 擴增65-70°C 均可 70°C 反應
2. 配制 LAMP 反應體系
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x Primer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
反應體系配好后，置于 65-70°C 反應 20~30min。
3. 試劑的凍干反應（僅限專業人員）本試劑可供具有凍干經驗的人員直接進行后續凍干，試劑的配方對凍干條件不苛刻。但對于不同的用戶來講，由于凍干形式、凍干體積、上機量、凍干容器、凍干磨具等因素存在差異，以下程序僅供參考。進一步的程序優化均需根據具體情況自行調整。對于非專業人員來講，請直接采購  的凍干制品，或委托訂制。
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
25xPrimer Mix 1 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
Total 12 μl
制品成型后的凍干程序：
-50℃預凍 10min； -50℃ 4-8h（真空段）；-50℃升溫到 25℃（每小時升溫 5℃）；25℃ 2h； 25℃恒溫。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環數:

其他參數選定后，PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多，非特異擴增增加。

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