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pBM28 Toposmart 克隆試劑盒

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更新時間:2024-01-12 13:11:54瀏覽次數:589

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產品簡介

供貨周期 現貨 規格 20 次
貨號 A-Hc2213 應用領域 化工
主要用途 僅供科研研究實驗    
pBM28 Toposmart 克隆試劑盒公司正在出售的產品:人肝癌細胞Luciferase熒光穩轉株 氨基末端激2封閉多肽 貝巴魯病毒PCR檢測試劑盒 大鼠磷脂A2(PL-A2)ELISA檢測試劑盒 輔ⅡNADP(H)含量活性比色法檢測試劑盒 太平洋火色桿菌 環指蛋白92抗體

詳細介紹

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pBM28 Toposmart 克隆試劑盒

20

A-Hc2213

保存條件:-20℃保存。
產品介紹:
利用痘苗病毒的拓撲異構酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將PCR產物定向克隆到線性化的pBM28載體中。適用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5 等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產物。pBM28 載體類似于公司的pENTR/D-TOPO入門載體, 具有attL1 和attL2,為gateway系統中的入門載體。引物M13F(-21)和M13R可用于菌落PCR和測序鑒定。
65.jpg產品特點:
(1)連接反應僅需 5 分鐘。
(2)只適合平末端 PCR 產物的快速、高效、定向克隆。
(3)載體采用了新的制備工藝,零背景,無需藍白斑篩選。
(4)與pBM27載體相比,pBM28載體無標簽序列。
(5)載體為壯觀霉su抗性。
注意事項:
(1)引物要求:PCR 引物5’端不能進行磷酸化修飾,普通商業化引物即可。上游引物的5’ 端添加CACC 四個堿基(CACC 為真核表達所必需的Kozak 序列)。
(2)DNA 聚合酶:選用Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和Xerox 等高保真DNA 聚合酶用于PCR 擴增。
(3)連接時間:5-15 分鐘,一般為 15 分鐘。
(4)連接溫度:室溫 (22℃-37℃),可使用PCR儀控溫。最佳反應溫度為25℃。若片段有高GC等復雜結構,可在37℃反應。
(5)產物要求:為保證PCR產物完整,建議72℃后延伸5-10分鐘。連接前使用瓊脂糖凝QQ截圖20240110094643.jpg



67.jpg


PCR基本步驟及注意事項?

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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