Protein G aMagnetic Beads蛋白G磁珠公司正在出售的產品：人甲狀腺癌細胞　促腎上腺皮質釋放激受體2封閉多肽　禽腺病毒PCR檢測試劑盒　大鼠抗雙鏈DNA抗體/天然DNA抗體(dsDNA) 試劑盒 ELISA　氨N去甲基化（AND）活性比色法檢測試劑盒　麥根腐平臍蠕孢　FAM50B蛋白抗體

商品屬性：

Protein G Magnetic Beads 是大小均勻，具有分散度的，表面共價綴合超純（純度>97％）的重組蛋白 G 的二氧化硅基質超順磁珠。這種磁珠是經過專門設計，并經過嚴格質量管理檢測的，主要用于當使用的一級抗體確定時，用于免疫沉淀和細胞分選。 同時，也被廣泛用于從血清樣品，腹水，血漿或組織培養上清中快速和有效的一步純化多個種類的IgG 蛋白。表1總結了本磁珠的結合親和力和特異性。

產品特點：

·適用于快捷，簡便的一步高通量程序;無需純化柱或過濾器，或者重復的移液或離心(Fig.1) ·由于磁珠的親水性表面，非特異性結合率極低

·結合容量

·對樣本體積要求低，便于自動化操作

·性價比高

產品屬性：

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緩沖液成分：

·.Protein G Beads (懸浮在 10 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.1% BSA,1 mM EDTA, pH7.4, 0.1% NaN3 緩沖液中) ·1x Protein G Binding/Washing Buffer (57.7 mM Na2HPO4,42.3 mM NaH2PO4, pH 7.0) ·1x Protein G Elution Buffer (0.2 M Glycine/HCl,pH 2.5) ·1x Protein G Neutralization Buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)

所需耗材：

磁力分離器（適用于手動操作）：根據實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇以下不同型號的磁力分離器：8 孔磁力架可以容納 8 個單獨的 1.5-2.0 ml離心管; 24 孔磁力架可以容納 24 個單獨的 1.5-2.0 ml 離心管; 4 孔磁力-15 可以容納4 個單獨的15ml 離心管; 4 孔磁力架-50 可以容納四個單獨的 50 ml 離心管。

操作過程: 此過程可被等比例放大或縮小

提示：

1. 該方案是經過優化的，可用于純化來自不同來源的大多數IgG抗體。然而， 由于沒有兩種抗體相同，因此不可能為所有IgG純化設計一個通用試劑 盒。為了獲得最佳結果，每個用戶必須根據故障排除部分中的建議，確定純 化單個抗體時的最佳工作條件，尤其是弱結合抗體（見表1）。

2. 為確保離子強度和pH值的最佳結合條件，有必要在純化前用Binding/ Washingbuffer按照至少1:1比例稀釋血清樣品、腹水或組織培養物。通 過離心或 0.2μ m過濾器過濾，去除樣品中的任何不溶性物質。

3. 在純化IgG之前，用戶應將試劑盒中包含的所有試劑平衡至室溫。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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