商品屬性：

親和素（或鏈霉親和素）和生物su之間表現的相互作用，是已知的非共價相互作用最高的一種。親和素、鏈霉親和素、 單體親和素及其類似物已成為探針研究實驗中強大的親和配體工具，被廣泛應用于生化分析、診斷、親和純化和藥物遞送。Monomer Avidin Magnetic Beads是一種高度均勻的超順磁性微球，表面包裹著高密度的超純（>97%）亞單位單體親和素。單體親和素源自天然四聚體蛋白，它保留了與天然親和素相同的生物su結合特異性，但其生物su結合親和力會有顯著降低（kD=~10-8 M）。因此，通過使用溫和的洗脫條件，例如含有2 mM 生物su的緩沖液，就可以很容易地從單體親和素中洗脫結合的生物su化分子。本款磁珠經過專門設計、測試和質量控制，可用于免疫沉淀、細胞分選，以及從細胞裂 解液或雜交反應中快速一步捕獲生物su化分子，如DNA、RNA、抗體或蛋白質。

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產品特點：

·快捷，簡單的一步法高通量操作;無需純化柱或過濾器，或重復移液、離心等操作

（圖1）

·結合能力，在溫和的條件下洗脫結合的生物su化分子

·在溫和的洗脫條件下純化生物su化樣品

·極小的非特異性結合

·對樣本體積要求低，便于自動化操作

·成本低：只有市場同類產品磁珠價格的一半

·磁珠至少可以重復使用5次

緩沖液

·1x PBS Buffer (0.1 M 磷酸鈉, 0.15 M 氯化鈉; pH 7 ) ·1x Regeneration Buffer (0.1 M Glycine/HCl,pH 2.8) ·1x Blocking/Elution Buffer (2 mM D-生物su溶于 PBS)

磁力分離器（適用于手動操作）：根據實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇以下不同型號的磁力分離器： 8 孔磁力架可以容納 8 個單獨的 1.5-2.0 ml 離心管 ; 24

孔磁力架可以容納 24 個單獨的 1.5-2.0 ml 離心管; 4 孔磁力-15 可以容納 4 個單獨的15ml 離心管; 4 孔磁力架-50 可以容納四個單獨的 50 ml 離心管。

操作過程

操作過程中實驗體積可根據需要放大或者縮小

提示：在純化生物su化蛋白質、多肽和其他分子之前。用戶應將試劑盒中的所有試劑溫度 平衡至室溫，并用雙蒸餾水配制 1x 工作溶液。

1. 輕輕震動裝有磁珠的試劑瓶，直到磁珠懸浮。將 50µl 磁珠轉移到新試管中。

提示：客戶應根據每個實驗粗樣品中生物su化分子的數量，根據經驗確定最佳的磁珠

使用量。過多的磁珠會導致背景更高；磁珠使用量少會造成產量降低。我們建議純化50μg 生物su化分子添加 50μl 懸浮的磁珠。

2. 將試管放在磁力分離器上1 分鐘。當磁珠沉淀時，去除上清液。取下試管加入四倍 磁珠體積的d2H2O，充分混合。并將試管再次置于磁力分離器上1 分鐘，去除上清 液。

3. 按照步驟2 所述方式，用四倍磁珠體積的1x PBS 緩沖液清洗磁珠。

4. 加入三倍磁珠體積的1xBlocking / Elution Buffer，通過渦旋充分混合，并在室溫下培養5 分鐘。將試管放在磁力分離器上1 分鐘。去除上清液。

5. 加入六倍磁珠體積的1xRegenerationBuffer，通過渦漩充分混合，并將試管放在磁力分離 器上1 分鐘。去除上清液。

6. 加入四倍磁珠體積的1x PBS Buffer，并按照步驟2 所述方式清洗磁珠。這些磁珠可以隨時使用。

提示：必須立即使用磁珠，否則粘合能力將顯著降低。

7. 向磁珠中加入含有生物su化分子的樣品，通過移液器吹吸充分混合，并在室溫下緩慢旋轉培養30-60 分鐘。

8. 將試管放在磁力分離器上，保持試管留在分離器上的同時去除上清液。如步驟 2 所示， 用1x PBS 清洗磁珠，直到在280 nm 處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD280<0.05）。

9. 加入一倍磁珠體積的Blocking/Elution Buffer，通過移液器吹吸充分混合，并在室溫下培養 5-10 分鐘，將與磁珠結合的生物su化分子洗脫下來。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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