2×Taq Plus PCR MasterMix( 含綠染料）公司正在出售的產品：人侵襲性脈絡膜黑色瘤細胞　促性腺激調節睪丸RNA解旋封閉多肽　禽白血病/肉瘤病毒PCR檢測試劑盒　大鼠可溶性CD86(B7-2/sCD86)ELISA Kit　丙酮脫氫（PDH)活性比色法檢測試劑盒　嗜松青霉　PCID1蛋白抗體

公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

儲存條件：-20℃ 保存。

制品說明：

本產品包含Taq Plus DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液，濃度為2×。具有快速簡便、靈敏度高、特異性強、穩定性好等優點，可最大限度的減少人為誤差。使用時只需加入DNA模板和引物既可。

本產品使用方便快捷，能避免 PCR 操作過程中的污染，使用時只需取適量2×Taq PCR MasterMix溶液，加入模板和引物，并加入去離子水補足體積，使MasterMix溶液濃度為1×即可進行反應。使用前請保證充分溶解并混勻，操作需在冰上進行。

本產品有含染料和不含染料兩種。含染料產品中有兩種染料|（綠色染料和黃色染料），在電泳時會分開以監測遷移進度。青色的染料在1%的瓊脂糖凝膠中與3-5kb DNA片段的遷移率相同。黃色的染料在1%的瓊脂糖凝膠中比引物遷移得快（＜50bp）。

產品內容：0.05units/μl Taq Plus DNA Polymerase 、4mM MgCl2、0.4mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

質量控制：經檢測無外源核酸酶活性；PCR方法檢測無宿主殘余 DNA ；能有效地擴增人基因中的單拷貝基因；室溫存放一周，無明顯活性改變。

適用范圍：

基因檢測：本產品不同批次之間誤差很小，特別適合大規模基因檢測，半定量PCR實驗和微量DNA的檢測。

DNA擴增和一些有特殊結構的復雜模板和GC含量高（>60%），有二級結構等的擴增：DNA片段的PCR擴增、DNA標記、引物延伸、序列測定等。PCR產物帶A，純化后可直接用TA克隆。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環數:

其他參數選定后，PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多，非特異擴增增加。

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