RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液公司正在出售的產品：鴨胚肝間質細胞（永生化）　G蛋白偶聯嘌呤受體p2y12封閉多肽　滅鮭氣單胞菌PCR檢測試劑盒　大鼠膠原酶I(Collagenase I)ELISA檢測試劑盒　6磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）酶活性比色法檢測試劑盒　常現青霉　卷曲螺旋結構域蛋白25抗體

商品屬性：

保存條件：

室溫(18-25℃)保存1 年以上，如果使用時發現有沉淀或者析出，可以37℃水浴加熱重新溶解后使用，重新溶解后不會影響產品質量。
產品介紹：
RNAfixer 是一種液態的無毒的組織保存液體，可以迅速滲入新鮮組織細胞的胞漿中，在非凍狀態下原位穩定和保護細胞內的RNA。取下組織薄片后立刻浸入RNAfixer 保存并不影響將來提取RNA 的質量和數量。RNAfixer 消除了RNA 樣品需要立刻處理或者必須液氮保存的不方便。浸入RNAfixer 后，新鮮組織細胞中RNA 可以完好的在37℃下保存一天，在25℃下保存一周，4℃下保存一個月，在-20℃或-80℃下長期保存。
RNA 病毒樣品(如HCV 和HIV)可在37℃保存一個月。適用于動物組織（心、肝、腎、肌肉、睪丸、腦、脾等）、培養細胞、RNA 病毒、 果蠅、細菌、白細胞、一些植物組織等。
產品特點：
1.操作容易：將組織成適當大小，浸沒在RNAfixer 中即可使其RNA 不被降解。
2.無需液氮：使樣品的保存不需液氮,干冰或-80℃冰箱,尤其適用于臨床和野外樣品的快速和大規模采集。
3.方便運輸：處理過的樣品能在25℃保存一周,使樣品郵寄和運輸變得容易和便宜,有利學術合作和交流。
4.多次凍融: 經RNAfixer 處理的樣品可反復凍融多次, 其間可對樣品進行各種處理而不影響最終提取的RNA 的質量。
5.可比性強: RNAfixer 能減少大規模樣品處理中的誤差,增加各次實驗數間的可比性, 對大規模基因表達譜的分析尤其有用。
使用說明：
RNAfixer 只用于新鮮組織，浸泡入 RNAfixer 前禁止冷凍組織。只需要迅速將新鮮組織成長、寬，高任意一邊厚度<0.5 厘米浸泡入 RNAfixer 即可（只要有一邊厚度不超過 0.5 厘米，RNAfixer 可以迅速滲透，其它兩邊的尺寸并不重要）。將新鮮組織浸泡 在 5 倍體積的 RNAfixer 中，按照指示存放在適當的溫度。
1.動物組織 RNAfixer 并不破壞或者溶解組織結構，因此浸泡在 RNAfixer 中達到滲透平衡的組織 可以從 RNAfixer 中取出，然后切成更小的塊，然后放回到 RNAfixer 中下次繼續使用。小器官如小鼠肝、腎、脾不需要剪切,可以完整的存放在 RNAfixer 中。
推薦不同組織樣品的 RNAstore 使用量：

 2.植物組織很多植物組織直接浸泡入 RNAfixer 即可，有的植物有天然滲透屏障如臘質保護層，需要先破壞掉臘質層,便于 RNAfixer 滲透。
3.組織培養細胞細胞吹打下來后,離心收集細胞,棄上清，用冰浴的 PBS 緩沖液洗一次去除殘留培養液。將細胞懸浮在少量 PBS 緩沖液中。加入五到十倍體積 RNAfixer, 混均。
4.白細胞對于全血中白細胞的保存，需將白細胞從紅細胞和血清中分離出來，并按組織培養細胞一樣處理后，白細胞便能有效地保存在 RNAfixer 中。不要將全血、血漿或血清中的 RNA 保存在 RNAfixer 中，因為它們蛋白含量過高，與 RNAfixer 混合后易形成不溶的沉淀。
5.細菌
細菌并不能在 RNAfixer 中生長，但是 RNAfixer 并不破壞細菌，E. coli 在 4℃保存一個月仍舊可以提出完整的 RNA。
RNAfixer 中樣本的存放：
1.存放在-80℃樣品長期保存用。將 RNA fixer 中樣本放置于 4℃過夜，然后將樣本撈出，盡量去除干凈 RNAfixer 液體，然后放置于-80℃。對于組織培養細胞，則不需要去除RNAfixer，直接冷凍于-80℃，并不會裂解細胞。樣品使用時可以在室溫融化，并且還可以再次冷凍而不影響 RNA 的完整性和產量。
2.存放在-20℃將 RNAfixer 中樣本放置于 4℃過夜，然后轉移到-20℃。在-20℃樣品并不會被冰凍,但是可能會形成一些結晶，這并不會影響將來的 RNA 提取。樣品使用時可以在室溫 融化，并且還可以再次冷凍而不影響 RNA 的完整性和產量。
3.存放在 4℃樣本可以在 4℃存放一個月。
4.存放于 25℃存放于 25℃樣本的 RNA 在一周內保持完整，保存兩周的樣品 RNA 有輕微降解，勉強能用于northern analysis, 但是質量足夠用于nuclease protection assay or RT-PCR 。
5.存放于 37℃存放于 37℃樣本的 RNA 在 24 小時內保持完整，3 天的時候有部分降解。RNAfixer 保存樣本的 RNA 提取：將樣本從 RNAfixer 中取出,RNAfixer 可以直接倒入水池，用自來水沖即可，不需特殊處理。
1.組織
用干凈鑷子將樣本從 RNAfixer 中撈出，用吸水紙稍稍吸去殘留的 RNAfixer 后，可以和新鮮組織一樣按照液氮研磨，然后勻漿處理的標準程序進行提取 RNA。
2.細胞
對于儲存在 RNAfixer 中的細胞有兩種選擇。一是去除 RNAfixer 后提取 RNA, 另一個是直接從細胞和 RNAfixer 的混合物提取。
1）去除 RNAfixer 后提取 RNA存放于 RNAfixer 中的細胞變得不那么脆弱，可以承受較高的離心速度而不被裂解。 我們有在 5000g 離心成功收集細胞的經驗，由于每種細胞的強度不一樣，可以先用不重要的細胞做個預試驗，以保證在使用的速度下離心不會破壞細胞。另一個選擇是在離心前加等體積的 PBS 稀釋 RNAfixer 和細胞的混合物，以減少溶液的密度，使細胞溶液可以沉淀下來。
2）不去除 RNAfixer，直接提取 RNA
也可以直接加 10 倍體積的一步法提取試劑（如 TRIpure，TRI reagent）到細胞和RNAfixer 的混合物，然后按照正常步驟操作。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

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PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。