RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液公司正在出售的產品：鴨胚肝間質細胞（永生化）　G蛋白偶聯嘌呤受體p2y12封閉多肽　滅鮭氣單胞菌PCR檢測試劑盒　大鼠膠原酶I(Collagenase I)ELISA檢測試劑盒　6磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）酶活性比色法檢測試劑盒　常現青霉　卷曲螺旋結構域蛋白25抗體

公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

保存條件：－20℃保存半年以上。

產品介紹：

RNAsafe 含有數種特殊化合物，可使 RNase 失活，高效去除各種溶液或者反應緩沖液中可能存在的 RNase，從而防止 RNA 的降解。RNAsafe 可用于制備 RNA 懸浮液，并可加入到各種 RNA 的反應液中（如體外轉錄、逆轉錄、RT-PCR、探針制備、分子雜交、Nuclease Protection Assay 等）。滅活可能存在的微量 Rnase 污染，保持 RNA 穩定性，獲得更佳實驗結果。

產品特點：

1. 適合于各種緩沖液，包括不能由DEPC處理的Tris及MOPS緩沖液系統等。

2. 安全，方便地去除溶液中微量的RNase。

3. 處理過的溶液隨時可以再處理（60℃ 10-20 min），以去除任何可能發生的后續RNase污染。

4. 不影響逆轉錄酶、RNA聚合酶和耐熱DNA聚合酶的活性，可用于逆轉錄和體外轉錄反應。

5. 處理后不需高壓滅菌。

使用方法：

1. 本品為 20×濃縮液，在待處理的一般溶液或反應緩沖液中稀釋 20×RNAsafe 到終濃度為 1×的工作濃度。如：95μl 待處理溶液中可加 5μl RNAsafe。

2. 60℃處理 20 min 以使 RNase 失活。經 RNAsafe 處理后的溶液冷卻至室溫即可使用。處理過的溶液可再次處理（60℃ 10-20 min），以去除存儲過程中可能發生的 RNase 污染。溶液冷卻到室溫后再加入逆轉錄酶等對高溫敏感的酶制劑。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環數:

其他參數選定后，PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多，非特異擴增增加。

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